Curcuminoid-mediert antimikrobiell fotodynamisk terapi på en murinmodell av oral candidiasis

Summary

Denne protokollen beskriver anvendelsen av antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT) i en murinmodell av oral candidiasis. aPDT ble utført ved hjelp av en vannløselig blanding av curcuminoider og blått LED-lys.

Abstract

Antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT) har blitt grundig undersøkt in vitro, og prekliniske dyremodeller av infeksjoner er egnet for evaluering av alternative behandlinger før kliniske studier. Denne studien beskriver effekten av aPDT i en murinmodell for oral candidiasis. Førti mus ble immunsupprimert med subkutane injeksjoner av prednisolon, og tungene deres ble inokulert ved hjelp av en oral vattpinne som tidligere var dynket i en C. albicans-cellesuspensjon . Tetracyklin ble administrert via drikkevann i løpet av forsøket. Fem dager etter soppinokulering ble mus tilfeldig fordelt i åtte grupper; En niende gruppe ubehandlede uinfiserte mus ble inkludert som negativ kontroll (n = 5). Tre konsentrasjoner (20 μM, 40 μM og 80 μM) av en blanding av curcuminoider ble testet med et blått LED-lys (89,2 mW / cm²; ~ 455 nm) og uten lys (C + L + og C + L- grupper, henholdsvis). Lys alene (C-L+), ingen behandling (C-L-) og dyr uten infeksjon ble evaluert som kontroller. Data ble analysert med Welchs ANOVA- og Games-Howell-tester (α = 0,05). Oral candidiasis ble etablert hos alle infiserte dyr og visualisert makroskopisk gjennom tilstedeværelse av karakteristiske hvite flekker eller pseudomembraner på tungens dorsum. Histopatologiske seksjoner bekreftet en stor tilstedeværelse av gjær og filamenter begrenset til det keratiniserte laget av epitelet i C-L-gruppen, og tilstedeværelsen av soppceller ble visuelt redusert i bildene oppnådd fra mus utsatt for aPDT med enten 40 μM eller 80 μM curcuminoider. aPDT mediert av 80 μM curcuminoider fremmet en 2,47 log₁₀ reduksjon i kolonitall sammenlignet med de i C-L-gruppen (p = 0,008). Alle andre grupper viste ingen statistisk signifikant reduksjon i antall kolonier, inkludert fotosensibilisator (C+L-) eller lys alene (C-L+) grupper. Curcuminoid-mediert aPDT reduserte soppbelastningen fra musens tunger.

Introduction

Oral candidiasis (OC) er den viktigste soppinfeksjonen i munnhulen; det er forårsaket av overvekst av Candida spp. Predisponerende faktorer for OC inkluderer endokrin dysfunksjon, bruk av bredspektret antibiotika, radio- og kjemoterapi, ernæringsmessige mangler, xerostomi (lav spyttstrøm), protesebruk, dårlig hygiene og spesielt immunsuppresjon¹. Blant Candida-arter er Candida albicans den mest utbredte og virulente; Den finnes som en kommensalart i menneskekroppen og som et opportunistisk patogen. C. albicans har evnen til å endre sin morfologi fra kommensale gjærsopper (blastoporer) til patogene filamenter (hyfer og pseudohypfer)². De trådformede formene, spesielt hyfer, kan invadere vertsepitelet ved endocytose eller aktiv penetrasjon, forårsaker infeksjon³. Andre virulensfaktorer av C. albicans inkluderer adhesjon, biofilmdannelse og sekresjon av lipolytiske og hydrolytiske enzymer og toksiner, som lipaser, fosfolipaser, proteinaser og candidalysin⁴.

OC-behandlinger involverer bruk av antifungale midler, spesielt aktuelle polyener og azoler (nystatin og mikonazol)⁵. Imidlertid viser de bare kortsiktig effekt, og tilbakefall er hyppig. I tillegg har overforbruk av antifungale midler gitt opphav til problemet med antifungal resistensutvikling og spredning⁶. Derfor er det behov for alternative terapier, for eksempel antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT), som kombinerer en fotosensibilisator (PS) og lys ved en passende bølgelengde (den samme som for PS-absorpsjonen) i nærvær av oksygen. PSs er bundet til eller tatt opp av celler, og når de aktiveres av lys, produserer de reaktive oksygenarter (ROS) som er giftige for sensibiliserte celler⁷.

I aPDT er en av fotosensibilisatorene (PSs) ansatt curcumin (CUR), en naturlig forekommende forbindelse ekstrahert fra rhizomes av gurkemeieplanten (Curcuma longa L.). Curcumin har mange terapeutiske egenskaper, inkludert antiinflammatoriske, antioksidanter, anticancer og antimikrobielle evner ^8,9. En tidligere undersøkelse fant at aPDT ved bruk av CUR effektivt reduserte C. albicans i en murine modell av oral candidiasis uten å forårsake skade på vertens vev¹⁰. CUR er den viktigste curcuminoid ekstrahert fra gurkemeie, men andre polyfenoler, som demetoksycurcumin og bis-demetoksycurcumin, finnes også i denne planten. Curcuminoid-mediert aPDT viste antibakteriell aktivitet mot biofilm av Staphylococcus aureus dyrket i katetre¹¹. Men så vidt vi vet, er dens antifungal aktivitet mot C. albicans fortsatt uklar. Derfor evaluerte vi i denne studien aPDT mediert av et curcuminoidsalt mot C. albicans i en murinmodell av OC.

Protocol

Forskningsprotokollen for bruk av mus ble godkjent av Etisk komité for dyrebruk (saksnummer 05/2008 og 09/2020) ved School of Dentistry, Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) ble brukt som referansestamme. Seks uker gamle sveitsiske hunnmus (n = 45), med et kroppsmasseområde på 20-30 g, ble brukt i denne studien. Dyrene ble levert av São Paulo State University, UNESP, Botucatu.

1. Klargjøring av PS og valg av lyskilde for aPDT

1. Forbered PS i henhold til spesifikasjonene for stoffet som skal testes.
   MERK: I denne studien ble en vannløselig blanding av curcuminoider (CUR-basert vannløselig saltblanding¹²) brukt som PS (se materialtabell og figur 1). Fortynninger ved 20 μM, 40 μM og 80 μM (henholdsvis 15,6, 29,2 og 58,4 mg/l) ble tilberedt i ultrarent vann umiddelbart før bruk og oppbevart ved 5 °C.
2. Velg et lysutstyr med en passende bølgelengde (den samme som for PS-absorpsjonen) som er i stand til å belyse hele det fotosensibiliserte målet jevnt og samtidig uten å varme opp vevet.
   MERK: I denne studien ble det brukt et håndstykke som inneholdt en lysemitterende diode (LED, se materialfortegnelse), som ble designet ved Instituto de Física de São Carlos (Universitetet i São Paulo, São Carlos, SP, Brasil). Utgangseffekten som ble levert av lyset var 89,2 mW/cm² ved en blå bølgelengde på ca. 455 nm.

2. Fremstilling av C. albicans inoculum

1. Behold referansestammen C. albicans (ATCC 90028) i gjær-pepton-glukose (YEPD, se materialtabell) med 50 % glyserol ved -80 °C inntil bruk.
2. Tine den frosne stammen ved romtemperatur, fordel en 100 μL alikot på en petriskål med Sabouraud druesukkeragar (SDA) med kloramfenikol (se materialtabell), og inkuber ved 37 °C i 48 timer.
3. Overfør fem kolonier til 10 ml gjærnitrogenbuljong med 2% glukose (YNBg) medium og vokse aerobt ved 37 ° C i 16 timer.
4. Fortynn gjærkulturen i fersk YNBg (1:10) og inkuber aerobt ved 37 °C til den optiske tettheten når vekstfasen midt i loggen.
   MERK: Standardiser den mikrobielle vekstkurven for hvert laboratorium tidligere. I den nåværende forskningen fikk kulturer lov til å inkubere i rundt 8 timer, til de nådde midtloggfasen av vekst som indikert av den optiske tettheten ved 540 nm (OD₅₄₀), med en gjennomsnittlig verdi på 0,536 ± 0,062 vilkårlige enheter (gjennomsnittlig ± standardavvik [SD]).
5. Sentrifuger kulturen ved 5000 x g ved romtemperatur i 5 minutter, kast supernatanten og vask pelleten to ganger med samme volum sterilt fosfatbufret saltvann (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Bruk 100 μL alikoter for å utføre fire serielle 10 ganger fortynninger i PBS, spre fortynninger på SDA-plater, og inkuber ved 37 ° C i 48 timer for kolonitelling. Som standard brukes soppsuspensjoner i konsentrasjoner på ca. 4,5 × 10⁷ kolonidannende enheter per milliliter (CFU / ml)].

3. Induksjon av OC hos mus

MERK: Følgende metodikk ble tidligere beskrevet av Takakura et ^al.13 og gjengitt av vår gruppe^10,14, med noen modifikasjoner.

1. Tilfeldig fordeling av mus i ni grupper (n = 5), tilsvarende samme antall behandlinger (tilleggsfil 1).
   MERK: Munnhulen til mus bør være negativ for Candida-vekst . Dette må kontrolleres ved å swabbing munnhulen og plating prøven på SDA.
2. Hold dyrene i propylenkasser¹⁰ (5 mus per boks maks.), med trespon for gulvbelegg, i et temperaturkontrollert vivarium ved 23 ± 2 ° C under en 12/12 h lys / mørk syklus. Ingen spesifikk berikelse trenger å gis.
3. Vedlikehold mus på ekstrudert mus diett og filtrert vann ad libitum.
4. Subkutant injisere det immundempende legemidlet, prednisolon (100 mg/kg kroppsvekt, se materialfortegnelse), for første gang på dag én til alle medlemmene i gruppe C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ og C-L- (tilleggsfil 1).
   MERK: Hold mus fra samme gruppe i samme boks og overvåk dem daglig for tegn på stress og vekttap. Søk veterinærråd for smertestillende eller endret mat / vann hvis stress eller vekttap er notert.
5. Fra dag én og til slutten av forsøket, gi tetracyklinhydroklorid i drikkevann ved 0,83 mg / ml¹³.
6. Inokuler mustunger på dag to, inkludert gruppe C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ og C-L- (tilleggsfil 1), med C. albicans inoculum. Ikke inokuler musene fra den negative kontrollgruppen (NCtrl).
   1. Sedate dyr ved intramuskulær injeksjon av 10 mg/kg klorpromazinklorid (se materialfortegnelse) på hver lårmuskel før inokulering utføres.
   2. Utfør intraoral inokulering av musene ved å suge en steril vattpinne (en per dyr) i en tilberedt (dvs. tilberedt umiddelbart før inokulering) standardisert suspensjon av C. albicans.
   3. Plasser bedøvede mus i liggende stilling. Trekk tungen forsiktig ut av munnen med en steril tang. Gni hver muss tunge med en gjennomvåt vattpinne i 30 s. Overvåk mus til de gjenoppretter fra sedasjon.
7. På dag fem administreres en komplementær subkutan injeksjon av prednisolon (100 mg/kg kroppsvekt) for å opprettholde immunsuppresjonen.
   MERK: Denne protokollen er tilstrekkelig til å holde infeksjonen i 7 dager etter intraoral inokulering. Protokollens tidslinje er vist i figur 2.

4. Antimikrobiell fotodynamisk terapi og gjenoppretting av C. albicans fra orale lesjoner

1. På dag syv, før behandling, bedøves dyrene ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av ketaminhydroklorid (100 mg/kg kroppsvekt) kombinert med xylazin (10 mg/kg kroppsvekt) (se materialfortegnelse).
2. Plasser hvert dyr i liggende stilling på en puteenhet^14,15 utstyrt med rustfrie ståltråder som kan sløyfes rundt fortennene for å holde munnen åpen.
   MERK: Isotermiske pads anbefales for oppvarming av musene mens de er bedøvet, forhindrer hypotermi ved romtemperatur og unngår dødelighet relatert til anestesi¹⁵. Hvert bedøvet dyr bør overvåkes av mangel på abstinensrefleks når tærne klemmes for å bekrefte anestesidybden. En vedlikeholdsdose ketamin ved 1/3 den opprinnelige dosen (uten xylazin) kan administreres om nødvendig.
3. Med mandibelen og kinnene trukket tilbake, legg forsiktig tungen utenfor munnen.
4. For mus fra C + L + grupper, pipette 70 μL av PS på tungens dorsum (ved en av de testede konsentrasjonene). Hold musene i et mørkt miljø i en varighet på 20 minutter som en pre-bestrålingsperiode. Sørg for at tungen til hvert dyr forblir plassert inne i munnhulen i løpet av denne tiden for å forhindre at fotosensibilisatoren (PS) inntas.
5. Etter fotosensibiliseringsperioden, trekk tungen ut av munnen for belysning. Plasser LED-enheten på tungens dorsum og lys ved 37,5 J/cm² (7 min med den nåværende enheten) (figur 3).
6. For dyr fra C + L-gruppene, pipett 70 μL av PS ved en av de testede konsentrasjonene på tungens dorsum, og hold disse musene i mørket i 27 minutter.
7. For dyr fra C-L+-gruppen (behandlet med lys uten tidligere fotosensibilisering), pipett 70 μL steril saltoppløsning på tungens dorsum. Hold musene i mørket i 20 minutter og belys deretter tungen deres ved 37,5 J / cm² (7 min med den nåværende enheten).
8. For mus fra C-L-gruppen (verken behandlet med PS eller med lys), pipetter 70 μL steril saltoppløsning på tungens dorsum og hold dem i mørket i 27 minutter.
9. Gjenopprett C. albicans fra tungen til alle mus umiddelbart etter behandling. Tørk tungens dorsum i 1 min med en steril bomullspinne.
10. Plasser hver prøvepinne i et rør som inneholder 1 ml sterilt saltvann og virvel i 1 min for å resuspendere de mikrobielle cellene.
11. Utfør umiddelbart 10 ganger serielle fortynninger i PBS og plate 25 μL alikoter over SDA-plater i duplikat. Inkuber platene aerobt ved 37 °C i 48 timer.
12. Etter 48 timer, bruk en digital koloniteller (se materialtabell) for å bestemme antall gjærkolonier. Beregn C. albicans load (CFU/ml) for hvert dyr.
13. Transformer CFU / ml-verdier til logg₁₀ og analyser riktig i henhold til utformingen av eksperimentet og dataforutsetningene.
    MERK: I den nåværende undersøkelsen ble Welchs enveis ANOVA og Games-Howell post-hoc-test (α = 0,05)¹⁶ brukt.

5. Histopatologiske analyser

1. På dag åtte, bedøve mus med ketamin på 100 mg / kg kombinert med xylazin på 10 mg / kg via intraperitonial injeksjon og avlive dem med en overdose ketamin (200 mg / kg administrert via intraperiotonial). Bekreft døden ved å sjekke for fravær av respiratorisk bevegelse (apné), og fravær av hjerterytme (asystole).
2. Klem forsiktig tungen og trekk den ut av dyrets munn. Bruk en manuell skalpell, gjør et snitt før circumvallate papillene for kirurgisk å fjerne hele tungen uten å forårsake skade på de fremre og sentrale områdene.
3. Fest tungen i 10% bufret formalin (pH 7,2-7,4) i 24 timer og vask den i rennende vann i 2 timer.
4. Fortsett med inkludering i parafinprosessen: dehydrering, avklaring og impregnering^10,14.
5. Klipp serielle seksjoner (5 μm tykke) ved hjelp av en mikrotom, og fest deretter seksjonene på glasslysbilder. Fortsett å flekke disse seksjonene ved hjelp av periodisk syre-Schiff og hematoksylin (PAS-H) for histopatologisk undersøkelse og identifisering av sopp gjennom observasjon under et lysmikroskop.
6. Be en patolog, helst blind for gruppene som ble studert, om å undersøke vevsreaksjonen på grunn av C. albicans-infeksjon .
7. Beskrive vevets histologiske egenskaper (epitel og bindevev), spesielt lokale inflammatoriske responser av varierende intensitet.

Representative Results

Murine modellen av OC viste typiske hvite flekker og pseudomembraner på tungen til alle infiserte mus (figur 4A). C. albicans gjenvunnet fra C-L- dyr bekreftet vevskolonisering av denne mikroorganismen (verdier varierte fra 1,62 x 10⁴ til 4,80 x 10⁵ CFU / ml). Som forventet viste ikke dyr fra NCtr-gruppen noen vevsendringer eller kolonivekst etter prøvetaking (figur 4B).

aPDT reduserte levedyktigheten til C. albicans når curcuminoider ble brukt ved 80 μM for fotosensibilisering (figur 5). Gjennomsnittlig log_10-reduksjon oppnådd med 80 μM PS-mediert aPDT var 2,47, sammenlignet med den i C-L-gruppen (p = 0,008).

Antallet C. albicans-kolonier gjenfunnet fra mustunger var ikke signifikant forskjellig blant mus behandlet med curcuminoider uten belysning (C + L-grupper), mus behandlet med lys, men ikke tidligere fotosensibiliserte (C-L+ grupper) og ubehandlede mus (C-L-gruppe) (p ≥ 0,210).

Histologiske trekk ved tunger hos uinfiserte dyr (NCtr) viste normalt/friskt vev, inkludert intakt lamina propria, basalmembran og filiforme papiller (figur 6A). I kontrast, når man undersøkte de histopatologiske bildene av musens tunger fra C-L-gruppen, var det tydelig at gjær og filamenter var tilstede i det keratiniserte laget av epitelet, selv om det ikke var noen infiltrasjon av sopp. I underliggende bindevev ble det observert en mild inflammatorisk respons, primært mediert av mononukleære celler, og filiforme papiller var spesielt fraværende (figur 6B). Den histologiske analysen av musens tunger i både C + L- og C-L + gruppene viste lignende egenskaper. I motsetning til dette viste tungeseksjoner av mus behandlet med 80 μM curcuminoid-mediert aPDT et redusert antall soppceller, hovedsakelig begrenset til det keratiniserte laget av epitelet (figur 6C).

Figur 1: Fotosensibilisatorens kjemiske struktur. Den kjemiske strukturen til den vannløselige saltblandingen som brukes som fotosensibilisator, bestående av 53,4% naturlig curcumin og 46,6% andre curcuminoider (demetoksycurcumin og bis-demetoksykurkumin). Den endelige gjennomsnittlige molekylvekten er 730,32 g / mol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Protokolltidslinje for murinmodellen for oral candidiasis og aPDT. En tidslinje som beskriver protokollen for murinmodellen for oral candidiasis og antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Belysning av mustunger etter fotosensibilisering. Etter fotosensibilisering, (inkubasjon av infisert vev med fotosensibilisatoren), ble tunger opplyst ved 37,5 J / cm² ved hjelp av et blått (~ 455 nm) LED-lys. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Hvite lesjoner i murine oral candidiasis modell. (A) Representative bilder som viser de hvite lesjonene observert i murinmodellen for oral candidiasis. (B) Negativ (uinfisert) kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Candida albicans gjenfunnet fra tungene til mus. Data representerer gjennomsnittsverdier ± standardavvik for logg₁₀(CFU/ml) fra behandlingsgruppene. Welchs enveis ANOVA indikerte at effekten av behandlingene var statistisk signifikant forskjellig mellom gruppene (p < 0,001). Ulike små bokstaver (a, b, c) ved siden av gjennomsnittet indikerer statistisk signifikante forskjeller i henhold til Games-Howell-testen (s≤ 0,030). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Representative bilder av histologiske snitt av musetunger. Histologiske seksjoner av musetunger ble farget med PAS-H, og bildene ble tatt ved 200x. (A) Negative kontrollmus uten indusert oral candidiasis, fotosensibilisering og belysning (NCtr-gruppe). (B) Mus med indusert oral candidiasis, verken fotosensibilisert eller utsatt for LED-belysning (C-L-gruppe). (C) Dyr med indusert oral candidiasis, utsatt for 80 μM curcuminoider og 37,5 J/cm² LED-belysning (C + L + 80 gruppe). Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Eksperimentelle grupper. En liste over eksperimentelle grupper benyttet i denne studien. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

C. albicans har vært assosiert med orale og esophageal infeksjoner hos personer med immunkompromittert tilstand, diabetes mellitus, langvarig bruk av antibiotika og dårlig munnhygiene ^1,3. Studier av smittsomme sykdommer hos mennesker krever både in vitro- og in vivo-undersøkelser før kliniske studier kan utformes trygt og nøyaktig. Denne studien beskriver en metode for å etablere en murinmodell av OC, som kan brukes til å evaluere patogenesen av orale infeksjoner av C. albicans og effekten av antifungale tilnærminger 15,16,17,18,19.

Murine modellen av OC som brukes her ble vellykket etablert, som det fremgår av den betydelige soppbelastningsgjenvinningen fra lesjoner, samt av de karakteristiske infeksjonstrekkene observert i makroskopiske og histopatologiske analyser av tunger av infiserte mus. Mange studier har brukt lignende murine modeller av OC. I slike modeller blir hunnmus immunsupprimert og inokulert med C. albicans, noe som resulterer i lesjoner på tungen 10,13,14,15,20,21. Immunsuppresjon med prednisolon, et glukokortikoid, hemmer aktiviteten til nøytrofiler mot C. albicans²². I denne studien ble hunnmus immunsupprimert med to subkutane injeksjoner med prednisolon, én dag før og tre dager etter infeksjon med C. albicans¹³. I tillegg forårsaket administrasjonen av tetracyklin i drikkevann i løpet av forsøket oral dysbiose ved å forstyrre orale bakterier og hjelpe C. albicans til å trives^23,24. Videre forhindret sedasjonen forårsaket av intramuskulær injeksjon av klorpromazinklorid dyrene i å drikke vann og spise umiddelbart etter inokulering. Dermed holdt soppceller kontakt med tungens dorsum i lengre tid, noe som muliggjorde utvikling av kimrør og overgangen fra gjær til filamenter (hyfer og pseudohyphae), som er de patogene morfologiene til C. albicans som kan invadere det menneskelige epitelet. Teichert et ^al.25 brukte en immunsviktprotokoll for å indusere OC hos mus og gjenvunnet bare 2 x 10² CFU / ml C. albicans.

Mens Totti et ^al.26 benyttet sialoadenectomized mus og gjennomførte fire separate inokulasjoner med en C. albicans suspensjon, er det bemerkelsesverdig at infeksjonen i deres tilfelle ikke ble opprettholdt hos de fleste dyr i løpet av forsøket. I motsetning til dette ble inokulasjonen med soppceller i denne studien utført bare en gang, og det resulterte i utvinning av 10^{4 CFU} / ml C. albicans fra munnhulen. Denne studien benyttet murine modell av candidiasis beskrevet av Takakura et ^al.13, som utførte oral inokulasjon med en klinisk stamme isolert fra en pasient med kutan candidiasis (10⁶ CFU / ml). Tre til syv dager etter inokulering ble 10^{5-10 6} CFU / ml C. albicans gjenfunnet fra munnhulen hos mus¹³. Forskjellene mellom metoden til Takakura et ^al.13 og denne studien inkluderer bruk av forskjellige soppkonsentrasjoner i inokulumet (denne studien brukte 10⁷ CFU / ml C. albicans) og forskjellige C. albicans-stammer for oral inokulasjon (referansestammen ATCC 90028 ble brukt her). Carmello et ^al.20 benyttet en lignende protokoll, som involverte bruk av immunsupprimerte dyr. Imidlertid administrerte de ytterligere to subkutane injeksjoner av prednisolon til dyrene på dag 1, 5, 9 og 13 av forsøket. Deres studie viste en positiv korrelasjon mellom score tildelt orale lesjoner av de infiserte dyrene og antall CFU / ml over en periode fra 5 til 16 dager etter infeksjon. Det har vært godt etablert i tidligere forskning at det er avgjørende å overvåke dyr nøye under anestesi for å forhindre hypotermi. Ytterligere vedlikeholdsdoser av ketamin bør administreres med diskresjon, kun når det er nødvendig²⁷.

Når det gjelder effekten av aPDT-applikasjon, viste resultatene at bestråling av tunger som tidligere ble behandlet med en 80 μM curcuminoid saltblanding forårsaket en signifikant reduksjon (2,47 log₁₀) i levedyktigheten til C. albicans. Histologiske analyser viste at snitt fra tunger behandlet med 80 μM curcuminoid-mediert aPDT viste redusert antall soppceller, som var begrenset til det keratiniserte laget, og lav inflammatorisk respons. Det er verdt å understreke at en inflammatorisk respons ble oppdaget hos alle mus som var infisert med C. albicans. Denne observasjonen innebærer at betennelsen observert i alle aPDT-gruppene kan være knyttet til Candida-infeksjon i stedet for å tilskrives aPDT, et konsistent funn i tråd med våre tidligere undersøkelser 10,13,14,15.

Tidligere undersøkelser brukte CUR, metylenblått og fotodithazin (PDZ) som PSs og oppnådde lovende resultater 10,20,24,25,27. I en lignende studie¹⁰ forårsaket en kombinert eksponering for CUR og LED-lys en signifikant reduksjon i levedyktigheten til C. albicans; Bruken av 80 μM CUR og lys reduserte imidlertid soppens levedyktighet med 4,0 log₁₀. Dovigo et ^al.10 brukte bare CUR som PS, mens vi brukte et salt som inneholder de tre viktigste curcuminoider fra C. longa. Når CUR (260 μM) og LED-lys ble brukt i fem påfølgende dager i behandlingen av oral candidiasis hos mus, observerte forfatterne en reduksjon på 1,11 log₁₀ i sopplevedyktighet²¹. Når metylenblått ble brukt som PS ved 450 μg/ml og 500 μg/ml, utryddet aPDT totalt C. albicans fra munnhulen hos mus²⁵. Videre, når aPDT ble mediert av PDZ (100 mg/L), ble det observert en reduksjon på 3,0 log₁₀ og fullstendig remisjon av orale lesjoner²⁰. I tillegg økte aPDT TNF-α-uttrykket sammenlignet med den i den ubehandlede gruppen²⁰. I en studie hvor en flukonazolresistent stamme ble brukt, fremmet aPDT mediert av PDZ (200 mg/L) en reduksjon tilsvarende_{1,3 log 10}²⁷. Videre resulterte kombinasjonen av aPDT med nystatin i en betydelig reduksjon i sopplevedyktighet, noe som utgjorde en reduksjon på 2,6 log₁₀, sammen med bemerkelsesverdige forbedringer i orale lesjoner og en reduksjon i inflammatorisk respons²⁷. Samlet gir disse studiene overbevisende bevis for effektiviteten av aPDT for å redusere soppbelastning innenfor murinmodellen for oral candidiasis, og understreker potensialet som et klinisk behandlingsalternativ på grunn av dets antimikrobielle effekt uten å forårsake skade på vertsvev.

Konklusjonen er at murinmodellen for OC som ble brukt i denne studien, er egnet for å etterligne infeksjon og evaluere aPDT-effekt. Som en begrensning benyttet OC-modellen som ble brukt her bare en referansestamme av C. albicans (andre stammer, kliniske isolater og ikke-albicans Candida-arter ble ikke evaluert). I tillegg kan kortikosteroidindusert immunsuppresjon som brukes i mus for å utvikle oral infeksjon, ikke etterligne andre immunsviktstilstander, slik som på grunn av HIV-infeksjon. Det kan også være forskjeller i vertsbetingelsene for å utvikle OC, for eksempel den orale mikrobiota hos mus og mennesker. Denne protokollen bør utvides ytterligere for å evaluere blandede biofilmer dannet av mer enn én art eller av forskjellige stammer fra samme art. Videre er det å holde mus tilstrekkelig bedøvet og forhindre hypotermi samtidig som man unngår anestesirelatert dødelighet de vanskeligste trinnene i protokollen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow