Summary
פרוטוקול זה מתאר את היישום של טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) במודל מורין של קנדידה אוראלית. aPDT בוצע באמצעות תערובת מסיסה במים של כורכומינואידים ואור LED כחול.
Abstract
טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) נחקר בהרחבה במבחנה, ומודלים פרה-קליניים של זיהומים בבעלי חיים מתאימים להערכת טיפולים אלטרנטיביים לפני ניסויים קליניים. מחקר זה מתאר את היעילות של aPDT במודל מורין של קנדידה אוראלית. ארבעים עכברים עברו דיכוי חיסוני באמצעות זריקות תת-עוריות של פרדניזולון, ולשונם חוסנה באמצעות מטוש אוראלי שהושרה בעבר בתרחיף תאי C. albicans . טטרציקלין ניתן באמצעות מי שתייה במהלך הניסוי. חמישה ימים לאחר החיסון הפטרייתי, עכברים חולקו באופן אקראי לשמונה קבוצות; קבוצה תשיעית של עכברים לא נגועים שלא טופלו נכללה כקבוצת ביקורת שלילית (n = 5). שלושה ריכוזים (20 μM, 40 μM ו-80 μM) של תערובת כורכומינואידים נבדקו עם נורת LED כחולה (89.2 mW/cm2; ~455 nm) וללא אור (קבוצות C+L+ ו-C+L, בהתאמה). אור בלבד (C-L+), ללא טיפול (C-L-), ובעלי חיים ללא זיהום הוערכו כקבוצת ביקורת. הנתונים נותחו באמצעות מבחני ANOVA ו-Games-Howell של וולש (α = 0.05). קנדידה אוראלית הוקמה בכל בעלי החיים הנגועים ודמיינה באופן מקרוסקופי באמצעות נוכחות של כתמים לבנים אופייניים או pseudomembranes על גבי הלשונות. חלקים היסטופתולוגיים אישרו נוכחות גדולה של שמרים וחוטים המוגבלים לשכבה הקרטיניסטית של האפיתל בקבוצת C-L, ונוכחותם של תאים פטרייתיים הופחתה חזותית בתמונות שהתקבלו מעכברים שנחשפו ל- aPDT עם כורכומינואידים של 40 מיקרומטר או 80 מיקרומטר. aPDT בתיווך כורכומינואידים של 80 מיקרומטר קידם ירידה של 2.47 לוג10 בספירת מושבות בהשוואה לאלה בקבוצת C-L- (p = 0.008). כל הקבוצות האחרות לא הראו ירידה מובהקת סטטיסטית במספר המושבות, כולל קבוצות פוטונסיטייזר (C+L-) או אור בלבד (C-L+). aPDT בתיווך כורכומינואיד הפחית את העומס הפטרייתי מהלשונות של עכברים.
Introduction
קנדידה אוראלית (OC) היא הזיהום הפטרייתי העיקרי של חלל הפה; זה נגרם על ידי צמיחת יתר של קנדידה spp. גורמים מקדימים לOC כוללים תפקוד אנדוקריני, שימוש באנטיביוטיקה רחבת טווח, רדיותרפיה וכימותרפיה, חסרים תזונתיים, קסרוסטומיה (זרימת רוק נמוכה), שימוש בשיניים תותבות, היגיינה לקויה, ובמיוחד, דיכוי חיסוני1. מבין מיני הקנדידה , קנדידה אלביקנס היא הנפוצה והארסית ביותר; הוא נמצא כמין קומנסלי בגוף האדם וכפתוגן אופורטוניסטי. ל-C. albicans יש את היכולת לשנות את המורפולוגיה שלו משמרים קומנסליים (blastopores) לחוטים פתוגניים (hyphae ו-pseudohyphae)2. צורות נימה, במיוחד hyphae, יכול לפלוש אפיתל המארח על ידי אנדוציטוזה או חדירה פעילה, גרימת זיהום3. גורמי אלימות אחרים של C. albicans כוללים הידבקות, היווצרות ביופילם והפרשת אנזימים ורעלים ליפוליטיים והידרוליטיים, כגון ליפאזות, פוספוליפאזות, פרוטאינאזות וקנדידליזין4.
טיפולי OC כוללים שימוש בחומרים אנטי פטרייתיים, במיוחד פוליאנים ואזולים מקומיים (ניסטטין ומיקונזול)5. עם זאת, הם מראים יעילות רק לטווח קצר, והישנות היא תכופה. בנוסף, שימוש יתר של antifungals הוליד את הבעיה של התפתחות עמידות אנטי פטרייתית והתפשטות6. לכן, יש צורך בטיפולים אלטרנטיביים, כגון טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT), המשלב פוטו-נסיטייזר (PS) ואור באורך גל מתאים (זהה לזה של ספיגת PS) בנוכחות חמצן. PSS קשורים לתאים או נקלטים בהם, וכאשר הם מופעלים על ידי אור, הם מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS) שהם רעילים לתאים רגישים7.
ב-aPDT, אחד הפוטונסיטייזרים (PSs) שבהם נעשה שימוש הוא כורכומין (CUR), תרכובת טבעית המופקת מקני השורש של צמח הכורכום (Curcuma longa L.). יש לכורכומין תכונות טיפוליות רבות, כולל יכולות אנטי דלקתיות, נוגדות חמצון, אנטי-סרטניות ונוגדות חיידקים 8,9. מחקר קודם מצא כי aPDT באמצעות CUR הפחית ביעילות C. albicans במודל murine של קנדידה אוראלית מבלי לגרום נזק לרקמות המארח10. CUR הוא הכורכומינואיד העיקרי המופק מכורכום, אבל גם פוליפנולים אחרים, כמו דמתוקסיכורכומין וביס-דמתוקסיכורכומין, נמצאים בצמח זה. aPDT בתיווך כורכומינואיד הדגים פעילות אנטיבקטריאלית נגד ביופילמים של סטפילוקוקוס זהוב שגודלו בצנתרים11. עם זאת, למיטב ידיעתנו, פעילותו האנטי פטרייתית נגד C. albicans עדיין אינה ברורה. לכן, במחקר זה, הערכנו aPDT בתיווך מלח כורכומינואיד כנגד C. albicans במודל מורין של OC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול המחקר לשימוש בעכברים אושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים (מספרי תיקים 05/2008 ו-09/2020) בבית הספר לרפואת שיניים, ארארקוארה, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) שימש כזן הייחוס. נקבות עכברים שוויצריות בנות שישה שבועות (n = 45), עם טווח מסת גוף של 20-30 גרם, שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים סופקו על ידי אוניברסיטת סאו פאולו, UNESP, Botucatu.
1. הכנת PS ובחירת מקור האור עבור aPDT
- הכינו את ה-PS בהתאם למפרט של החומר שייבדק.
הערה: במחקר זה, תערובת מסיסה במים של כורכומינואידים (תערובת מלח מסיסה במים12 על בסיס CUR) שימשה כ-PS (ראו טבלת חומרים ואיור 1). דילולים ב-20 מיקרומטר, 40 מיקרומטר ו-80 מיקרומטר (15.6, 29.2 ו-58.4 מ"ג/ליטר, בהתאמה) הוכנו במים טהורים במיוחד מיד לפני השימוש ונשמרו בטמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס. - בחר ציוד קל בעל אורך גל מתאים (זהה לזה של בליעת PS) המסוגל להאיר את כל המטרה הפוטונסיטית באופן אחיד ובו זמנית מבלי לחמם את הרקמה.
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בפריט המכיל דיודה פולטת אור (LED, ראה טבלת חומרים), שתוכננה במכון פיסיקה דה סאו קרלוס (אוניברסיטת סאו פאולו, סאו קרלוס, SP, ברזיל). הספק היציאה שסיפק האור היה 89.2 mW/cm2 באורך גל כחול של כ-455 ננומטר.
2. הכנת חיסון C. albicans
- יש לשמור את זן הייחוס C. albicans (ATCC 90028) בשמרים-פפטון-גלוקוז (YEPD, ראו טבלת חומרים) עם 50% גליצרול בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
- מפשירים את הזן הקפוא בטמפרטורת החדר, מורחים אליקוט של 100 מיקרוליטר על צלחת פטרי עם אגר דקסטרוז סאבורו (SDA) עם כלוראמפניקול (ראו טבלת חומרים), ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 48 שעות.
- מעבירים חמש מושבות לתוך 10 מ"ל של ציר חנקן שמרים עם 2% גלוקוז (YNBg) בינוני וגדלים באופן אירובי ב 37 ° C במשך 16 שעות.
- לדלל את תרבית השמרים ב- YNBg טרי (1:10) ולדגור באופן אירובי ב 37 ° C עד שהצפיפות האופטית מגיעה לשלב אמצע לוג הגידול.
הערה: תקנן את עקומת הצמיחה המיקרוביאלית עבור כל מעבדה בעבר. במחקר הנוכחי, תרביות הורשו לדגור במשך כ-8 שעות, עד שהגיעו לשלב אמצע היומן של הצמיחה כפי שמצוין על ידי הצפיפות האופטית ב-540 ננומטר (OD540), עם ערך ממוצע של 0.536 ±-0.062 יחידות שרירותיות (ממוצע ± סטיית תקן [SD]). - צנטריפוגו את התרבית בטמפרטורה של 5,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה פעמיים באותו נפח של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS; 0.136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4).
- השתמש 100 μL aliquots לביצוע ארבעה דילולים טוריים פי 10 ב- PBS, פיזר דילולים על לוחות SDA, ודגר ב 37 ° C במשך 48 שעות לספירת מושבה. כסטנדרט, מתלים פטרייתיים משמשים בריכוזים של כ 4.5 × 107 יחידות יוצרות מושבה למיליליטר (CFU/mL)].
3. השראת OC בעכברים
הערה: המתודולוגיה הבאה תוארה בעבר על ידי Takakura et al.13 ושוחזרה על ידי הקבוצה שלנו10,14, עם כמה שינויים.
- פיזור אקראי של עכברים בתשע קבוצות (n = 5), בהתאם למספר זהה של טיפולים (קובץ משלים 1).
הערה: חלל הפה של עכברים צריך להיות שלילי לצמיחת קנדידה . זה צריך להיבדק על ידי ספוג חלל הפה ציפוי הדגימה על SDA. - שמור את בעלי החיים בקופסאות פרופילן10 (5 עכברים לכל היותר תיבה), עם שבבי עץ לחיפוי הרצפה, בויבריום מבוקר טמפרטורה ב 23 ± 2 ° C תחת מחזור אור / חושך 12/12 שעות. אין צורך לספק העשרה ספציפית.
- שמור על עכברים על דיאטת עכברים מושחלת ומים מסוננים ad libitum.
- הזרקה תת עורית של התרופה לדיכוי מערכת החיסון, פרדניזולון (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף, ראה טבלת חומרים), לראשונה ביום הראשון לכל חברי הקבוצות C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ ו-C-L- (קובץ משלים 1).
הערה: שמור עכברים מאותה קבוצה באותה קופסה ועקוב אחריהם מדי יום עבור כל סימן של מתח וירידה במשקל. פנה לייעוץ וטרינרי עבור משכך כאבים או מזון / מים שהשתנו אם מתח או ירידה במשקל הם ציינו. - החל מהיום הראשון ועד סוף הניסוי, לספק טטרציקלין הידרוכלוריד במי שתייה ב 0.83 מ"ג / מ"ל13.
- חסן לשונות עכברים ביום השני, כולל קבוצות C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ ו- C-L- (קובץ משלים 1), עם החיסון C. albicans . אין לחסן עכברים מקבוצת הביקורת השלילית (NCtrl).
- הרדמת בעלי חיים על ידי הזרקה תוך שרירית של 10 מ"ג / ק"ג כלורפרומזין כלוריד (ראה טבלת חומרים) על כל שריר הירך לפני ביצוע חיסון.
- בצע חיסון אינטרה-אוראלי של העכברים על ידי השריית ספוגית סטרילית (אחת לכל חיה) לתרחיף מתוקנן טרי (כלומר, מוכן מיד לפני החיסון) של C. albicans.
- הניחו עכברים מורדמים במצב שכיבה. מוציאים בעדינות את לשונם מפיהם באמצעות מלקחיים סטריליים. שפשפו את לשונו של כל עכבר במקלון ספוג במשך 30 שניות. עקוב אחר עכברים עד שהם מתאוששים מהרגעה.
- ביום החמישי, יש לתת זריקה תת עורית משלימה של פרדניזולון (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) כדי לשמור על הדיכוי החיסוני.
הערה: פרוטוקול זה מספיק כדי לשמור על הזיהום במשך 7 ימים לאחר חיסון תוך אוראלי. ציר הזמן של הפרוטוקול מוצג באיור 2.
4. טיפול פוטודינמי אנטי מיקרוביאלי והחלמה של C. albicans מנגעים אוראליים
- ביום השביעי, לפני הטיפול, יש להרדים את בעלי החיים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) בשילוב עם קסילזין (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) (ראו טבלת חומרים).
- הניחו כל בעל חיים במצב שכיבה על מכשיר כרית 14,15 המצויד בחוטי נירוסטה שניתן לכרוך בלולאה סביב החותכות כדי לשמור על הפה פתוח.
הערה: רפידות איזותרמיות מומלצות לחימום העכברים בזמן טשטוש, מניעת היפותרמיה בטמפרטורת החדר ומניעת תמותה הקשורה להרדמה15. כל בעל חיים מורדם צריך להיות מנוטר על ידי היעדר רפלקס נסיגה כאשר בהונות הם צובטים כדי לאשר את עומק ההרדמה. ניתן לתת מנת תחזוקה אחת של קטמין ב-1/3 מהמינון המקורי (ללא קסילזין) במידת הצורך. - כאשר הלסת התחתונה והלחיים נסוגות, מניחים בעדינות את הלשון מחוץ לפה.
- עבור עכברים מקבוצות C+L+, פיפטה 70 μL של PS על גבי הלשון (באחד הריכוזים שנבדקו). יש לשמור על העכברים בסביבה חשוכה למשך 20 דקות כתקופת טרום הקרנה. ודא כי במהלך זמן זה, הלשון של כל בעל חיים נשאר ממוקם בתוך חלל הפה כדי למנוע את photoensitizer (PS) מלהיות בליעה.
- לאחר תקופת הפוטוסנסיטיזציה, משוך את הלשון מהפה להארה. הניחו את התקן ה-LED על גבי הלשון והאירו ב-37.5 J/cm2 (7 דקות עם המכשיר הנוכחי) (איור 3).
- עבור בעלי חיים מקבוצות C+L, פיפטה 70 μL של PS באחד הריכוזים שנבדקו על גבי הלשון, ולשמור עכברים אלה בחושך במשך 27 דקות.
- עבור בעלי חיים מקבוצת C-L+ (מטופלים באור ללא פוטונסיטיזציה קודמת), פיפטה 70 μL של תמיסת מלח סטרילית על גבי הלשון. שמור את העכברים בחושך במשך 20 דקות ולאחר מכן להאיר את לשונם ב 37.5 J / cm2 (7 דקות עם המכשיר הנוכחי).
- עבור עכברים מקבוצת C-L- (לא מטופלים עם PS ולא עם אור), פיפטה 70 μL של תמיסת מלח סטרילית על גבי הלשון ולשמור אותם בחושך במשך 27 דקות.
- לשחזר C. albicans מן הלשון של כל העכברים מיד לאחר הטיפול. ספוג את החלק האחורי של הלשון במשך דקה אחת עם צמר גפן סטרילי.
- הניחו כל מטוש דגימה בצינור המכיל 1 מ"ל של מלח סטרילי ומערבולת למשך דקה אחת כדי להשעות מחדש את התאים המיקרוביאליים.
- מיד לבצע דילולים טוריים פי 10 ב PBS צלחת 25 μL aliquots מעל לוחות SDA כפול. לדגור את הצלחות באופן אירובי ב 37 ° C במשך 48 שעות.
- לאחר 48 שעות, השתמש במונה מושבות דיגיטלי (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את ספירת מושבות השמרים. חשב עומס C. albicans (CFU/mL) עבור כל חיה.
- הפוך ערכי CFU/mL ליומן10 וננתח כראוי בהתאם לתכנון הניסוי והנחות הנתונים.
הערה: בחקירה הנוכחית, נעשה שימוש במבחן ANOVA ו-Games-Howell החד-כיווני של וולש (α = 0.05)16 .
5. ניתוחים היסטופתולוגיים
- ביום השמיני, מרדימים עכברים עם קטמין במינון של 100 מ"ג/ק"ג בשילוב עם קסילזין במינון של 10 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תוך פריטוניאלית וממיתים אותם עם מנת יתר של קטמין (200 מ"ג/ק"ג הניתנת באמצעות אינטרפריוטוניאל). אשר את המוות על ידי בדיקת היעדר תנועה נשימתית (דום נשימה), והיעדר פעימות לב (אסיסטולה).
- בזהירות לצבוט את הלשון ולשלוף אותו מתוך הפה של החיה. באמצעות אזמל ידני, לבצע חתך לפני papillae circumvallate כדי להסיר בניתוח את כל הלשון מבלי לגרום לפציעות באזורים הקדמיים והמרכזיים.
- מקבעים את הלשון בפורמלין חוצץ 10% (pH 7.2-7.4) למשך 24 שעות ושוטפים אותה במים זורמים למשך שעתיים.
- המשך עם ההכללה בתהליך הפרפין: התייבשות, הבהרה והספגה10,14.
- חתכו מקטעים טוריים (בעובי 5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוטום, ולאחר מכן הדביקו את המקטעים על שקופיות זכוכית. המשך להכתים חלקים אלה באמצעות חומצה תקופתית Schiff ו hematoxylin (PAS-H) לבדיקה היסטופתולוגית וזיהוי פטריות באמצעות תצפית תחת מיקרוסקופ אור.
- בקש מפתולוג, רצוי עיוור לקבוצות שנחקרו, לבחון את תגובת הרקמה עקב זיהום C. albicans .
- תאר את המאפיינים ההיסטולוגיים של הרקמה (אפיתל ורקמת חיבור), במיוחד תגובות דלקתיות מקומיות בעוצמות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל מורין של OC הראה כתמים לבנים טיפוסיים ופסאודוממברנות על הלשון של כל העכברים הנגועים (איור 4A). C. albicans שנמצאו מבעלי חיים C-L אישרו התיישבות רקמות על ידי מיקרואורגניזם זה (הערכים נעו בין 1.62 x 104 ל 4.80 x 105 CFU/mL). כצפוי, חיות מקבוצת NCtr לא הראו שינויים כלשהם ברקמות או צמיחת מושבה לאחר הדגימה (איור 4B).
aPDT הפחית את הכדאיות של C. albicans כאשר כורכומינואידים שימשו ב-80 מיקרומטר לפוטוסנסיטיזציה (איור 5). ההפחתה הממוצעת של log10 שהושגה עם aPDT בתיווך PS של 80 מיקרומטר הייתה 2.47, בהשוואה לזו שבקבוצת C-L- (p = 0.008).
מספר מושבות C. albicans שנמצאו בלשונות עכברים לא היה שונה באופן משמעותי בין עכברים שטופלו בכורכומינואידים ללא הארה (קבוצות C+L), עכברים שטופלו באור אך לא עברו פוטונזיט קודם לכן (קבוצות C-L+), ועכברים לא מטופלים (קבוצת C-L) (p ≥ 0.210).
המאפיינים ההיסטולוגיים של לשונות של חיות לא נגועות (NCtr) הראו רקמות נורמליות/בריאות, כולל למינה פרופריה שלמה, קרום בסיסי ופפילות פיליפורמיות (איור 6A). לעומת זאת, כאשר בחנו את התמונות ההיסטופתולוגיות של לשונות העכברים מקבוצת C-L, ניכר כי שמרים וחוטים היו נוכחים בתוך שכבת הקרטין של האפיתל, אם כי לא הייתה חדירה של פטריות. ברקמת החיבור הבסיסית נצפתה תגובה דלקתית קלה, בעיקר בתיווך תאים חד-גרעיניים, ופפילות פיליפורמיות נעדרו באופן בולט (איור 6B). הניתוח ההיסטולוגי של לשונות עכברים בשתי קבוצות C+L- ו- C-L+ הראה מאפיינים דומים. לעומת זאת, חלקי הלשון של עכברים שטופלו ב-aPDT בתיווך כורכומינואיד של 80 מיקרומטר חשפו מספר מופחת של תאים פטרייתיים, המוגבלים בעיקר לשכבת הקרטין של האפיתל (איור 6C).
איור 1: המבנה הכימי של הפוטונסיטייזר. המבנה הכימי של תערובת המלחים המסיסה במים המשמשת כפוטונסיטייזר, כולל 53.4% כורכומין טבעי ו-46.6% כורכומינואידים אחרים (דמתוקסיכורכומין וביס-דמתוקסיכורכומין). המשקל המולקולרי הממוצע הסופי הוא 730.32 גרם/מול. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציר הזמן של פרוטוקול עבור מודל מורין של קנדידה אוראלית ו-aPDT. ציר זמן המתאר את הפרוטוקול עבור מודל מורין של קנדידה אוראלית וטיפול פוטודינמי מיקרוביאלי (aPDT). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הארה של לשונות עכברים לאחר פוטוסנסיטיזציה. לאחר פוטוסנסיטיזציה, (הדגירה של הרקמה הנגועה עם הפוטונסיטייזר), הלשונות הוארו ב 37.5 J / cm2 באמצעות אור LED כחול (~ 455 ננומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נגעים לבנים במודל קנדידיזיס אוראלי מוריני. (A) תמונות מייצגות המתארות את הנגעים הלבנים שנצפו במודל מורין של קנדידה אוראלית. (B) בקרה שלילית (לא נגועה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: קנדידה אלביקנס התאוששה מלשונות של עכברים. הנתונים מייצגים ערכים ממוצעים ± סטיית תקן של log10 (CFU/mL) מקבוצות הטיפול. ANOVA חד-כיווני של וולש הצביע על כך שהשפעות הטיפולים היו שונות באופן מובהק סטטיסטית בין הקבוצות (p < 0.001). אותיות קטנות שונות (a, b, c) ליד האמצעים מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית על פי מבחן גיימס-האוול (עמ≤ 0.030). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונות מייצגות של מקטעים היסטולוגיים של לשונות עכברים. חלקים היסטולוגיים של לשונות עכברים הוכתמו ב-PAS-H, והתמונות צולמו ברזולוציה של 200x. (A) עכברי ביקורת שליליים ללא קנדידה אוראלית מושרית, פוטוסנסיטיזציה והארה (קבוצת NCtr). (B) עכברים עם קנדידה מושרית דרך הפה, לא עברו פוטונזיט ולא נחשפו לתאורת LED (קבוצת C-L). (C) בעלי חיים עם קנדידה אוראלית מושרית, שנחשפו לכורכומינואידים של 80 מיקרומטר ולתאורת LEDשל 37.5 J/cm 2 (קבוצת C+L+ 80). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: קבוצות ניסוי. רשימה של קבוצות הניסוי ששימשו במחקר הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. albicans נקשר לזיהומים בפה ובוושט אצל אנשים עם מצב של מדוכאי חיסון, סוכרת, שימוש ממושך באנטיביוטיקה והיגיינת פה לקויה 1,3. המחקר של מחלות זיהומיות בבני אדם דורש הן חקירות חוץ גופיות והן חקירות in vivo לפני שניתן יהיה לתכנן ניסויים קליניים בצורה בטוחה ומדויקת. המחקר הנוכחי מתאר שיטה להקמת מודל מורין של OC, אשר ניתן להשתמש בו כדי להעריך את הפתוגנזה של זיהומים אוראליים על ידי C. albicans ואת היעילות של גישות אנטי פטרייתיות 15,16,17,18,19.
מודל ה-murine של OC המשמש כאן התבסס בהצלחה, כפי שמעידים התאוששות העומס הפטרייתי המשמעותי מנגעים, כמו גם על ידי תכונות הזיהום האופייניות שנצפו בניתוחים המקרוסקופיים וההיסטופתולוגיים של לשונות של עכברים נגועים. מחקרים רבים השתמשו במודלים דומים של OC. במודלים כאלה, נקבות עכברים מדוכאות חיסון ומחוסנות ב- C. albicans, וכתוצאה מכך נגעים על הלשון 10,13,14,15,20,21. דיכוי חיסוני עם פרדניזולון, גלוקוקורטיקואיד, מעכב את פעילות הנויטרופילים נגד C. albicans22. במחקר זה, נקבות עכברים עברו דיכוי חיסוני בשתי זריקות תת-עוריות של פרדניזולון, יום לפני ושלושה ימים אחרי ההדבקה ב-C. albicans13. בנוסף, מתן טטרציקלין במי השתייה במהלך הניסוי גרם לדיסביוזיס אוראלי על ידי הפרעה לחיידקי הפה ועזר ל- C. albicans לשגשג23,24. יתר על כן, ההרגעה שנגרמה על ידי הזרקה תוך שרירית של כלורפרומזין כלוריד מנעה מבעלי החיים לשתות מים ולאכול מיד לאחר החיסון. לפיכך, תאים פטרייתיים נשארו במגע עם גבי הלשון במשך זמן רב יותר, מה שאיפשר התפתחות של צינורות נבט ומעבר משמרים לחוטים (hyphae ו pseudohyphae), שהם מורפולוגיות פתוגניות של C. albicans שיכול לפלוש לאפיתל האנושי. Teichert et al.25 השתמשו בפרוטוקול כשל חיסוני כדי לגרום לOC בעכברים והשיבו רק 2 x 102 CFU/mL של C. albicans.
בעוד Totti et al.26 השתמשו בעכברים שעברו כריתה וביצעו ארבעה חיסונים נפרדים עם תרחיף C. albicans, ראוי לציין כי במקרה שלהם, הזיהום לא היה מתמשך ברוב בעלי החיים במהלך הניסוי. לעומת זאת, במחקר הנוכחי, החיסון עם תאים פטרייתיים בוצע רק פעם אחת, והוא הביא להתאוששות של 104 CFU/mL של C. albicans מחלל הפה. מחקר זה השתמש במודל מורין של קנדידה שתואר על ידי Takakura et al.13, שביצעו חיסון אוראלי עם זן קליני שבודד מחולה עם קנדידה עורית (106 CFU/mL). שלושה עד שבעה ימים לאחר החיסון, 10 5-10 6 CFU/mL של C. albicans נמצאו מחלל הפה של עכברים13. ההבדלים בין השיטה של Takakura et al.13 לבין מחקר זה כוללים שימוש בריכוזים פטרייתיים שונים בחיסון (מחקר זה השתמש ב-107 CFU/mL של C. albicans) וזני C. albicans שונים לחיסון אוראלי (זן הייחוס ATCC 90028 שימש כאן). כרמלו ועמיתיו השתמשו בפרוטוקול דומה, שכלל שימוש בבעלי חיים מדוכאי חיסון. עם זאת, הם נתנו שתי זריקות תת עוריות נוספות של פרדניזולון לבעלי החיים בימים 1, 5, 9 ו -13 של הניסוי. המחקר שלהם גילה מתאם חיובי בין הציונים שהוקצו לנגעים אוראליים של בעלי החיים הנגועים לבין מספר CFU/mL על פני תקופה שנעה בין 5 ל -16 ימים לאחר ההדבקה. זה כבר מבוסס היטב במחקרים קודמים כי חיוני לעקוב מקרוב אחר בעלי חיים תחת הרדמה כדי למנוע היפותרמיה. מנות תחזוקה נוספות של קטמין צריכות להינתן בשיקול דעת, רק בעת הצורך27.
לגבי היעילות של יישום aPDT, התוצאות הראו כי הקרנה של לשונות שטופלו בעבר בתערובת מלח כורכומינואידים של 80 מיקרומטר גרמה לירידה משמעותית (2.47 לוג10) בכדאיות של C. albicans. ניתוחים היסטולוגיים גילו כי מקטעים מלשונות שטופלו ב-aPDT בתיווך כורכומינואיד של 80 מיקרומטר הראו מספר מופחת של תאים פטרייתיים, שהיו מוגבלים לשכבת הקרטין, ותגובה דלקתית נמוכה. ראוי להדגיש כי תגובה דלקתית זוהתה בכל העכברים שנדבקו ב- C. albicans. תצפית זו מרמזת כי הדלקת שנצפתה בכל קבוצות ה- aPDT עשויה להיות קשורה לזיהום קנדידה ולא מיוחסת ל- aPDT, ממצא עקבי העולה בקנה אחד עם החקירות הקודמות שלנו 10,13,14,15.
מחקרים קודמים השתמשו ב- CUR, מתילן כחול ופוטודיתאזין (PDZ) כ- PSs והשיגו תוצאות מבטיחות 10,20,24,25,27. במחקר דומה10, חשיפה משולבת לאור CUR ו-LED גרמה לירידה משמעותית בכדאיות של C. albicans; עם זאת, השימוש ב-80 מיקרומטר CUR ואור הפחית את הכדאיות הפטרייתית ב-4.0 לוג10. Dovigo et al.10 השתמשו רק ב-CUR כ-PS, ואילו אנחנו השתמשנו במלח המכיל את שלושת הכורכומינואידים העיקריים מ-C. longa. כאשר נעשה שימוש ב-CUR (260 מיקרומטר) ובאור LED במשך חמישה ימים רצופים בטיפול בקנדידה אוראלית בעכברים, החוקרים הבחינו בירידה של 1.11 לוג10 בכדאיות פטרייתית21. כאשר מתילן כחול שימש כ-PS ברמות של 450 מיקרוגרם/מ"ל ו-500 מיקרוגרם/מ"ל, aPDT חיסל לחלוטין את C. albicans מחלל הפה של עכברים25. יתר על כן, כאשר aPDT תווך על ידי PDZ (100 מ"ג / ליטר), נצפתה הפחתה של 3.0 log10 והפוגה מלאה של נגעים אוראליים20. בנוסף, aPDT הגדיל את ביטוי TNF-α בהשוואה לזה בקבוצה שלא טופלה20. במחקר שבו נעשה שימוש בזן עמיד לפלוקונזול, aPDT בתיווך PDZ (200 מ"ג/ליטר) קידם הפחתה שוות ערך ל-1.3 לוג1027. יתר על כן, השילוב של aPDT עם ניסטטין הביא לירידה משמעותית בכדאיות הפטרייתית, שהסתכמה בירידה של 2.6 לוג10, יחד עם שיפורים ניכרים בנגעים אוראליים וירידה בתגובה הדלקתית27. באופן קולקטיבי, מחקרים אלה מספקים ראיות משכנעות ליעילות של aPDT בהפחתת העומס הפטרייתי במודל מורין של קנדידה אוראלית, ומדגישים את הפוטנציאל שלו כאפשרות טיפול קלינית בשל יעילותו האנטי-מיקרוביאלית מבלי לגרום נזק לרקמות המארחות.
לסיכום, מודל ה-murine של OC המשמש במחקר זה מתאים לחיקוי זיהום ולהערכת יעילות aPDT. כמגבלה, מודל OC המשמש כאן השתמש רק בזן ייחוס אחד של C. albicans (זנים אחרים, מבודדים קליניים וזני קנדידה שאינם אלביקנס לא הוערכו). בנוסף, הדיכוי החיסוני המושרה על ידי קורטיקוסטרואידים המשמש בעכברים לפתח זיהום אוראלי עשוי שלא לחקות מצבים אחרים של כשל חיסוני, כגון זה עקב זיהום HIV. ייתכנו גם הבדלים בתנאי הפונדקאי להתפתחות OC, כגון מיקרוביוטה אוראלית של עכברים ובני אדם. פרוטוקול זה צריך להיות מורחב עוד יותר כדי להעריך ביופילמים מעורבים שנוצרו על ידי יותר ממין אחד או על ידי זנים שונים מאותו מין. יתר על כן, שמירה על עכברים מורדמים כראוי ומניעת היפותרמיה תוך הימנעות מתמותה הקשורה להרדמה הם השלבים הקשים ביותר של הפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים על התמיכה הכספית של FAPESP (קרן המחקר של סאו פאולו, מספר תהליך FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) ו- 2008/00601-6. אנו מודים גם לד"ר אנה פאולה סילבה על אספקת המידע על מלח מסיס במים המבוסס על CUR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E.
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Marôco, J. Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , ReportNumber 7th ed, Lisboa, Portugal. (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L. Jr, Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
