Summary
Her presenterer vi en protokoll for å visualisere transport av monokarboksylater, glukose og ATP i gliaceller og nevroner ved hjelp av genetisk kodede Förster-resonansenergioverføringsbaserte sensorer i et ex-vivo Drosophila larvehjernepreparat.
Abstract
De høye energikravene til hjernen på grunn av elektrisk aktivitet er et av deres mest karakteristiske trekk. Disse kravene oppfylles ved produksjon av ATP fra glukose og dets metabolitter, slik som monokarboksylater, laktat og pyruvat. Det er fortsatt uklart hvordan denne prosessen er regulert eller hvem de viktigste aktørene er, spesielt i Drosophila.
Ved hjelp av genetisk kodede Förster resonans energioverføringsbaserte sensorer presenterer vi en enkel metode for å måle transport av monokarboksylater og glukose i gliaceller og nevroner i et ex-vivo Drosophila larvehjernepreparat. Protokollen beskriver hvordan man dissekerer og fester en larvehjerne som uttrykker en av sensorene til et glassdeksel.
Vi presenterer resultatene fra et helt eksperiment der laktattransport ble målt i larvehjerner ved å slå ned tidligere identifiserte monokarboksylattransportører i gliaceller. Videre demonstrerer vi hvordan man raskt kan øke nevronaktiviteten og spore metabolittendringer i den aktive hjernen. Den beskrevne metoden, som gir all nødvendig informasjon, kan brukes til å analysere andre Drosophila levende vev.
Introduction
Hjernen har høye energibehov på grunn av de høye kostnadene ved å gjenopprette iongradienter i nevroner forårsaket av nevronal elektrisk signalgenerering og overføring, samt synaptisk overføring 1,2. Denne høye energietterspørselen har lenge vært antatt å bli møtt av kontinuerlig oksidasjon av glukose for å produsere ATP3. Spesifikke transportører ved blod-hjernebarrieren overfører glukosen i blodet til hjernen. Konstante glykemiske nivåer sikrer at hjernen får en jevn tilførsel av glukose4. Interessant nok tyder økende eksperimentelle bevis på at molekyler avledet fra glukosemetabolisme, som laktat og pyruvat, spiller en viktig rolle i hjernecellenes energiproduksjon 5,6. Imidlertid er det fortsatt en viss debatt om hvor viktige disse molekylene er for energiproduksjon og hvilke celler i hjernen som produserer eller bruker dem 7,8. Mangelen på passende molekylære verktøy med den høye tidsmessige og romlige oppløsningen som kreves for denne oppgaven, er et betydelig problem som har forhindret at denne kontroversen blir fullstendig løst.
Utviklingen og anvendelsen av flere konstruerte fluorescerende metabolske sensorer har resultert i en bemerkelsesverdig økning i vår forståelse av hvor og hvordan metabolitter produseres og brukes, samt hvordan metabolske flukser oppstår under basal og høy nevronaktivitet9. Genetisk kodede metabolske sensorer basert på Förster resonans energioverføring (FRET) mikroskopi, som ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glukose), Laconic (laktat) og pyronisk (pyruvat), har bidratt til vår forståelse av hjernens energimetabolisme 10,11,12,13. På grunn av de høye kostnadene og det sofistikerte utstyret som kreves for å utføre eksperimenter på levende dyr eller vev, er resultatene i virveldyrmodeller imidlertid fortsatt primært begrenset til cellekulturer (gliaceller og nevroner).
Den nye bruken av Drosophila-modellen for å uttrykke disse sensorene har avslørt at viktige metabolske egenskaper er bevart på tvers av arter, og deres funksjon kan enkelt adresseres med dette verktøyet. Enda viktigere er at Drosophila-modellen har kastet lys over hvordan glukose og laktat/pyruvat transporteres og metaboliseres i fluehjernen, koblingen mellom monokarboksylatforbruk og minnedannelse, og den bemerkelsesverdige demonstrasjonen av hvordan økninger i nevral aktivitet og metabolsk fluks overlapper 14,15,16,17. Metoden som presenteres her for å måle monokarboksylat-, glukose- og ATP-nivåer ved hjelp av genetisk kodede FRET-sensorer uttrykt i larvehjernen, gjør det mulig for forskere å lære mer om hvordan hjernen til Drosophila bruker energi, som kan brukes på hjernen til andre dyr.
Vi viser at denne metoden er effektiv for påvisning av laktat og glukose i gliaceller og nevroner, og at en monokarboksylattransportør (Chaski) er involvert i laktatimport til gliaceller. Vi demonstrerer også en enkel metode for å studere metabolittendringer under økt nevronaktivitet, som lett kan induseres ved badapplikasjon av en GABA A-reseptorantagonist. Til slutt viser vi at denne metoden kan brukes til å måle monokarboksylat og glukosetransport i andre metabolsk signifikante vev, for eksempel fettlegemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedlikehold av flystammer og synkronisering av larver
- For å utføre disse eksperimentene, bruk fluekulturer hevet ved 25 ° C på standard Drosophila mat sammensatt av 10% gjær, 8% glukose, 5% hvetemel, 1,1% agar, 0,6% propionsyre og 1,5% metylparaben.
- For å følge denne protokollen, bruk følgende linjer: w1118 (eksperimentell kontrollbakgrunn), OK6-GAL4 (driver for motorneuroner), repo-GAL4 (driver for alle gliaceller), CG-GAL4 (driver for fettlegemer), UAS-Pyronic (pyruvatsensor), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glukosesensor), UAS-Laconic (laktatsensor), UAS-GCaMP6f (kalsiumsensor), UAS-AT1.03NL (ATP-sensor) og UAS-Chk RNAi GD1829. Alle linjene som uttrykker sensorer eller RNAi er i w1118 genetisk bakgrunn.
- For å oppnå synkronisert tredje instar vandrende larver, plasser 300 fluer (3-5 dager gamle, 100 hanner, 200 jomfruhunner) av ønsket genetisk kryss i eggleggingskammeret, som inneholder en 60 mm petriskål dekket med 1% agarose i fosfatbufret saltoppløsning (PBS). Legg en dråpe væske/kremet gjær (1,5 cm diameter) i midten av plakket for å oppmuntre fluene til å legge egg (figur 1).
- Hold fluene ved 25 °C i 3 dager, og erstatt petriskålen agarose med en frisk og nyoppløst gjær to ganger daglig.
- La fluene legge egg i 4 timer på den fjerde dagen før du bytter petriskål. Fjern denne plaketten. Deretter, i 3 timer, la fluene legge egg i en ny agaroseplakett med nyoppløst gjær. Bruk disse larvene i forsøkene.
- Etter 3 timer, fjern plakket som inneholder eggene og legg det i en 25 ° C inkubator i 24 timer.
- Samle 50 til 100 nyklekte larver fra dette plakket (0 timer etter larveklekking) og legg dem i et plastflaske som inneholder standard mat. For å la larvene mate riktig, sørg for at maten er malt og myk. Bruk larvene 96 timer etter overføringen.
2. Lag glassdekslene med poly-L-lysin
- Utfør dette trinnet 1 time før larvedisseksjonen. I en 6-brønns cellekulturplate plasserer du 25 mm glassdeksler (diameteren på dekslene som skal brukes, avhenger av opptakskammeret som er tilgjengelig i mikroskopet).
- Plasser en dråpe (300 μL) poly-L-lysin i midten av hvert deksel i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask hvert deksel 3x med destillert vann, deretter 2x med en saltoppløsning uten Ca2+ (den samme løsningen som brukes til å dissekere larver, se trinn 3.2). Monter dekslene i opptakskammeret og fyll det med Ca2+-fri saltoppløsning.
MERK: Selv om larvehjernen kan feste seg direkte til glassdekslene, er adhesjonen svak, og hjernen beveger seg eller forskyver seg av og til under forsøket på grunn av den kontinuerlige strømmen av saltoppløsning. Tilsetningen av poly-L-lysintrinnet reduserer risikoen for bevegelser eller til og med hjernetap som følge av vaskene.
3. Dissekere ventral nerve ledning (VNC) og fettlegemer (FBs)
- Samle de vandrende tredje instar larver fra ønsket genetisk kryss (fra trinn 1.7) og vask dem grundig 3x med destillert vann.
- Plasser larvene i en glassdisseksjonsskålbrønn som inneholder 750 μL nominelt null Ca2+ iskald saltvannsoppløsning bestående av 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES og 35 mM sukrose (pH = 6,7, målt med pH-måler og justert med 1 M NaOH og HCl 37% v/v).
MERK: Innstilling av pH til 6,7 er kritisk fordi, som tidligere observert, monokarboksylattransport er svært avhengig av løsningens pH. I tillegg tilsvarer 6,7 pH i hemolymfen til en tredje stjernelarve17,18. - Plasser larven under et stereomikroskop og lag et tverrgående kutt over baksiden av magen med et par tang.
- Skyv kjeven med tangen mens du snur larvene innvendig ut.
- Observer den ventrale nervestrengen (VNC) ved siden av kjeven. Fjern forsiktig de imaginære platene og gjenværende hjernekaudale vev.
- Separer VNC med den sentrale hjernen og optiske lober fra resten av vevet ved å kutte nerver. Overfør VNC, plukk den opp med tang fra de gjenværende nervene, og plasser den i opptakskammeret som inneholder den Ca2+-frie opptaksløsningen (samme løsning fra trinn 3.2). VNC-ene vil umiddelbart feste seg til dekslene.
- For å unngå forstyrrelser fra de resterende nervene, fest dem nederst på dekslet med tang (nervene vil også være fluorescerende avhengig av driverlinjen som brukes) (figur 2).
- For å utføre eksperimenter i fettlegemer (FB) som måler glukose eller monokarboksylattransport i et annet sett med eksperimenter, fortsett å isolere vevene ved å følge trinn 3.1-3.4. Når larvene er vendt innvendig ut, må du observere at FB er et hvitt, bilateralt, flatt vev.
- Plasser de isolerte FB-ene som uttrykker FRET-sensorene (oppnådd fra et genetisk kryss ved hjelp av passende drivere) i opptakskammeret som inneholder opptaksløsningen uten Ca2+.
MERK: FB er svært hydrofob (det har en tendens til å flyte på overflaten av løsningen) og ekstremt sårbar for manipulering med tang, det må håndteres med forsiktighet. Enhver røff håndtering av dette vevet vil resultere i døde celler senere (med redusert fluorescens av sensorene). - Plasser opptakskammeret som inneholder VNC / FBs på mikroskopstadiet.
4. Levende celleavbildning
- For å skaffe bilder av vevsuttrykkende sensorer, bruk et oppreist fluorescensmikroskop koblet til et utslippssplittingssystem og et CCD-kamera. Slå på belysningssystemet til mikroskopet 30 minutter før du starter et eksperiment.
MERK: Her bruker vi et Spinning Disk fluorescensmikroskop utstyrt med et 20x/0.5 vannnedsenkingsmål for å observere både VNC og FB. Figur 2 viser også bruken av et 40x/0.8 vannnedsenkingsmål. - For å visualisere GCaMP6f-fluorescens, sett eksitasjons - og utslippsbølgelengdene på henholdsvis 488 nm og 540 nm. For lakoniske/pyroniske/ATP/glukosesensorer, sett eksitasjonsbølgelengden på 440 nm og emisjonsbølgelengdene ved 488 nm (mTFP, CFP) og 540 nm (Venus, YFP).
- Skaff bilder på 512 x 512 piksler størrelse hver 2 s for GCaMP6f og hver 10-30 s for Laconic / Pyronic / ATP / glukose sensorer. Bestem optimal eksponering for lyskilden, observere kvaliteten på bildet som er oppnådd. For å følge denne protokollen, sørg for at bildene har 300 ms eksponering for lakoniske og pyroniske sensorer og 100-150 ms for glukose - og ATP-sensorene .
MERK: Eksponeringen kan variere avhengig av bruk av et konfokal eller normalt fluorescensmikroskop. - Når opptakskammeret er installert i mikroskopets stadium, plasser forsiktig vannnedsenkingsmålet og vær sikker på at målet forblir nedsenket gjennom hele forsøket. Hold romtemperaturen på 25 °C.
- Koble opptakskammeret til et perfusjonssystem og hold vevet badet i opptaksoppløsningen som inneholder 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES og 35 mM sukrose, pH 6,7 (målt med pH-måler og justert med NaOH og HCl).
- Oppretthold en konstant strøm på 3 ml/min opptaksoppløsning gjennom vevet ved hjelp av tyngdekraften, koblet til en peristaltisk pumpe med lav fluks for å trekke ut væsken fra kammeret samtidig som volumet holdes konstant. For å oppnå den nødvendige strømningen, plasser de løsningsholdige rørene (50 ml plastrør) 25 cm over mikroskoptrinnet.
MERK: Denne tyngdekraftdrevne strømmen brukes til å forhindre vevsbevegelse forårsaket av peristaltiske pumper, noe som muliggjør mer nøyaktig bildeanalyse senere. - Før stimulering, hold opptaksløsningen flytende i 5-10 minutter for å oppnå en stabil grunnlinje av fluorescens fra sensorene. Endre varigheten etter behov for å få denne grunnlinjen.
- Erstatt den flytende løsningen med stimuleringsløsningen i 5 minutter for å stimulere VNC / FBs (med glukose, pyruvat eller laktat i konsentrasjonen beskrevet for hvert eksperiment oppløst i saltoppløsning; se hver figur).
MERK: Varigheten av stimuleringen kan varieres i henhold til eksperimentets behov (for eksempel kan glukosepulser økes til 10 minutter for å nå et platå i nevroner, som tidligere rapportert16). - For å opprettholde osmolariteten i stimuleringsløsningen, korriger sukrosekonsentrasjonen (et karbohydrat som ikke metaboliseres av Drosophila-hjernen ) i henhold til konsentrasjonen av monokarboksylat eller glukose tilsatt.
- Endre løsningene ved hjelp av et enkelt ventilsystem. Vær forsiktig så du ikke flytter mikroskopstadiet.
- Utsett VNC til 80 μM picrotoxin (PTX, kontinuerlig flytende) for å stimulere nevronaktivitet. Denne prosedyren øker frekvensen av Ca2+ svingninger, noe som gjør det mulig å observere endringer i metabolsk relevante molekyler (f.eks. intracellulær ATP).
- På slutten av ethvert eksperiment, vask grundig hele strømningssystemet, inkludert rørene og opptakskammeret, i minst 10 minutter med saltoppløsningen og ytterligere 10 minutter med destillert vann for å eliminere spor av løsningene som brukes.
5. Bildebehandling og dataanalyse
- For å behandle bildene som er oppnådd, fortsett med trinnene vist i figur 3.
- Importer bildet (lakonisk) til ImageJ-programvaren. Bildet har to visninger av prøven: den venstre er mTFP-signalet og den til høyre er Venus-signalet. Velg et område som inkluderer cellene som skal analyseres, og skill disse bildene (mTFP og Venus) i et nytt vindu. Forsikre deg om at disse bildene inneholder nøyaktig samme område.
- Åpne registreringspluggen og korriger den lille driften av vevet som normalt observeres i forsøket med funksjonen stiv kropp. Utfør dette i begge bildene (mTFP og Venus).
- Velg minst 10 interesseområder (ROI) i cytosolen til de tilsvarende 10 cellene i mTFP-signalet (488 nm) og overfør valgene til Venus-bildet (540 nm).
- Velg to eller tre avkastninger nær cellene som analyseres, men uten merkbart signal (alltid innenfor VNC eller vevet som analyseres, se figur 3). Dette er bakgrunnsavkastningen.
- Når avkastningen er valgt i begge bildene, får du den gjennomsnittlige gråverdien for hvert signal ved hjelp av funksjonsmålet. Overfør dataene til et dataark og trekk fra den gjennomsnittlige bakgrunnsverdien for hvert signal.
- Bestem mTFP-fluorescensforholdet over Venus (for lakonisk og pyronisk). Denne verdien beregnes annerledes enn de andre FRET-sensorene som er beskrevet her (hvor forholdet vanligvis er YFP / CFP) fordi når de er bundet til deres respektive substrater, reduserer både lakonisk og pyronisk FRET-effektiviteten.
- Normaliser dataene som deler hver registrerte verdi med grunnlinjen. I et eget datablad beregner du grunnlinjen ved å ta middelverdien av mTFP/Venus-forholdet i løpet av de siste 2 minuttene før stimulansen.
- For glukose- og ATP-målingene ved hjelp av FRET-baserte sensorer, beregn YFP/CFP-forholdet og normaliser dataene som beskrevet i trinn 5.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I opptil 1 time tillater denne prosedyren enkel måling av intracellulære endringer i fluorescensen til monokarboksylat- og glukosesensorer. Som vist i figur 4 responderer lakoniske sensorer i både gliaceller og motornevroner på 1 mM laktat med tilsvarende hastighet ved starten av pulsen, men motornevroner når en høyere økning over grunnlinjen i løpet av 5 min puls, som tidligere vist17. Denne laktatkonsentrasjonen ble valgt fordi den er sammenlignbar med nivåene som finnes i hemolymfen hos tredjestjerners larver. På samme måte, når VNC-uttrykkende glukosesensorer ble utsatt for 5 mM glukose (en verdi som ligner den som måles i hemolymfen av oss og andre19), økte sensorens signal med tilsvarende hastighet i gliaceller og nevroner. Under glukosepulsen øker imidlertid signalet i nevroner mer enn i gliaceller. Dette samsvarer med tidligere observasjoner av lignende FRET-sensoruttrykkende preparater16.
Dette preparatet kan brukes til å utføre eksperimenter på ubeskrevne monokarboksylat og glukosetransportører uttrykt i Drosophila gliaceller eller nevroner20. Her eksemplifiserer vi bruken av RNA-interferens for å vise at Chaski (Chk), som tidligere var kjent for å transportere monokarboksylater i heterologe celler, transporterer laktat i gliaceller (figur 5). Under ernæringsmessige begrensningsforhold ble denne transportøren beskrevet som å spille en viktig rolle i dyrs fysiologi og atferd21. Vi fant at i gliaceller reduserte utslag av Chk laktattransport sammenlignet med kontroll-VNC eksponert for 1 mM laktat (figur 5). Andre antatte transportører kan testes for å se om de kan transportere metabolitter under fysiologiske og patologiske forhold.
For å adressere studiet av metabolske endringer assosiert med nevronaktivitet, utviklet vi en enkel metode for å øke nevronaktiviteten uten å bruke teknisk komplekse prosedyrer som optogenetikk, noe som kan forstyrre FRET-sensormålinger (figur 6). Den isolerte VNC ble utsatt for pikrotoksin (PTX), en kjent GABA A-reseptorantagonist som tidligere ble brukt av oss og andre 17,22. Konsentrasjonen som brukes øker frekvensen av kalsiumoscillasjoner i nevroner (målt ved endringer i GCaMP6f-fluorescens) samt signifikante endringer i metabolsk relevante molekyler som glukose, laktat og pyruvat17. Videre resulterer PTX-induserte økninger i nevronaktivitet i et forbigående fall i ATP-nivåer i soma av motorneuroner. Dette fenomenet er tidligere beskrevet i virveldyrmodeller der nevronaktiviteten ble økt via elektrisk stimulering eller ved bruk av GABA A-reseptorantagonister 23,24. Som et resultat kan denne modellen brukes til å spore metabolske endringer i spesifikke delmengder av nevroner og glialceller, og adressere behovet for energirelaterte transportører som bidrar til ATP-produksjon under høy nevronaktivitet.
Glukose og monokarboksylattransport er også viktig i vev eller andre celler enn hjernen. Vi viser her visualisering av monokarboksylat (laktat/pyruvat) og glukoseopptak i fettlegemer, et metabolsk relevant vev tilstede i larver og voksenflue som har flere nøkkelfunksjoner som lipidlagring og metabolisering25. Lakonisk sensor er godt uttrykt i FB, som vist i figur 7, hvor lipiddråpene kan sees som små svarte kuler i cellen. Dette isolerte vevet fester seg godt til poly-L-lysinbelagte deksler, noe som muliggjør en langsiktig celleavbildningsprosedyre som også er enkel å analysere. Vi observerte en signifikant økning i fluorescensen til glukosesensoren når FB ble utsatt for økende glukosekonsentrasjoner (ca. 5 mM), som ligger nær glukosekonsentrasjonen som finnes i hemolymfen. Videre eksponering for høyere konsentrasjoner av glukose (10 mM) resulterer ikke i den forventede økningen i sensorfluorescens. Til slutt, i FB, kunne vi måle import av laktat og pyruvat (figur 7C,D). I dette tilfellet forårsaker økning av laktat- og pyruvatkonsentrasjonene en proporsjonal økning i lakonisk og pyronisk fluorescens (fra 0, 1 til 1 mM). Høyere monokarboksylatkonsentrasjoner resulterer i signalmetning inne i cellene.
Figur 1 Synkronisering av Drosophila-larver. Larvesynkroniseringsprosedyren er avbildet grafisk. To timer før prosessen starter, må 1% agaroseplater tilberedes og skiftes to ganger daglig frem til dag 4. Lukkelarver må samles med forsiktighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Isolert larvehjerne av typen Drosophila som uttrykker laktatsensoren lakonisk. (A) Et representativt bilde av en isolert Drosophila tredjestjernelarves separerte VNC festet til en poly-L-lysinbelagt dekkslip og uttrykker laktatsensoren Laconic i motorneuroner (OK6-GAL4). Bildene viser et lysfeltbilde av VNC (venstre) og sensorens mTFP-fluorescens (midtpanel) tatt med et 20x vannnedsenkningsmål. Bildene i bunnpanelet er av samme VNC tatt med et 40x vannnedsenkingsmål. (B) Motorneuroner fra en VNC som uttrykker den lakoniske laktatsensoren (OK6>Laconic) plassert i en nulllaktat saltoppløsning. Bildet viser mTFP-fluorescens (venstre), Venus-fluorescens (midten) og forholdet mellom de to fluorescensene (høyre, produsert ved hjelp av Ratio Plus-plugin fra ImageJ-programvaren). Skalastenger = 50 μm (A, topppanel), 10 μm (A bunnpanel, B). Forkortelser: VNC = ventral nervestreng; mTFP = monomert blågrønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Trinnvise analyser av bildene. En skjematisk illustrasjon av ImageJ-programvareprotokollen for bildeanalyse, som viser prosessen (første kolonne), ImageJ-kommandoer (andre kolonne) og bildebehandlingsresultater (tredje kolonne). Eksempelet starter med et råbilde tatt fra en VNC som uttrykker lakonisk laktatsensor i motornevroner (OK6-GAL4). Forkortelser: VNC = ventral nervestreng; mTFP = monomert blågrønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Monokarboksylat og glukosetransport i nevroner og gliaceller i larvehjernen Drosophila. (A) Representative bilder av VNC som uttrykker laktatsensoren Laconic i motorneuroner (OK6-Gal4>Laconic). Lakonisk fluorescens i motorneuroner ses før, under og etter en 5 min puls på 1 mM laktat. ImageJs Ratio Plus-plugin ble brukt til å lage forholdsbilder (mTFP / Venus). Skalastang = 10 μm. (B) Representative registreringer av FRET-signaler fra isolerte VNCer som uttrykker lakonisk laktatsensor i motornevroner (OK6-GAL4, grå linjer) eller gliaceller (REPO-GAL4, svarte linjer) utsatt for 1 mM laktat i 5 minutter. Sporene viser de justerte FRET-signalene til middelverdien samlet 2 minutter før laktateksponeringen. (C) Representative registreringer av FRET-signaler fra isolerte VNC-er som uttrykker glukosesensoren FLII12Pglu700μδ6 i motornevroner (OK6-GAL4, grå linjer) eller gliaceller (REPO-GAL4, svarte linjer) utsatt for 5 mM glukose i 5 minutter. Sporene viser de justerte FRET-signalene til middelverdien samlet to minutter før glukoseeksponeringen. Forkortelser: VNC = ventral nervestreng; mTFP = monomert blågrønt fluorescerende protein; FRET = Föster resonans energioverføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Laktattransport i gliaceller i larvehjernen Drosophila som uttrykker Chaski RNAi. (A) Isolert VNC som uttrykker laktatsensoren Laconic alene (genetisk kontroll, w1118, svart linje) eller samtidig uttrykker en RNAi for å slå ned Chaski (Chk) uttrykk (chk-RNAi, magenta) ble utsatt for 1 mM laktat i 5 minutter. For hver tilstand representerer sporene den gjennomsnittlige FRET-verdien oppnådd fra syv separate VNC (70 celler per tilstand, normalisert ved bruk av middelverdien oppnådd 2 minutter før de ble utsatt for laktat). (B) Arealet under kurven i A brukes til å beregne intracellulær laktatakkumulering. For hver tilstand er verdiene gjennomsnittlig SE fra 70 celler og syv uavhengige eksperimenter (kontroll eller chk-RNAi). Den uparede Student t-testen ble brukt til statistisk analyse (*p < 0,05). Forkortelser: VNC = ventral nervestreng; FRET = Föster resonans energioverføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Endringer i nevronale ATP-nivåer indusert av pikrotoksineksponering. Opptak av fluorescensen fanget fra VNCs som uttrykker den genetisk kodede (A) kalsiumsensoren GCaMP6f eller (B, et annet sett med eksperimenter) ATP-sensoren AT1.03NL i motorneuroner (OK6-GAL4) som ble utsatt for GABA A-reseptorantagonisten Picrotoxin (80 μM) i løpet av tiden indikert av linjen. Det representative opptaket kommer fra et enkelt motornevron fra en VNC (i A) eller gjennomsnittet ± SE fra 10 celler fra en enkelt VNC (i B) normalisert til gjennomsnittsverdiene oppnådd 2 minutter før PTX-eksponering. Forkortelser: VNC = ventral nervestreng; PTX = pikrotoksin; SE = standard feil; CFP = cyan fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Transport av monokarboksylat og glukose i Drosophila fettlegemer. (A) Bilde av den isolerte fettkroppen fra tredje stjernelarver som uttrykker laktatsensoren Laconic (mTFP-fluorescens). Skala bar = 10 μm. (B) Representative spor av det normaliserte signalet fanget i FB som uttrykker glukosesensoren (FLII12Pglu700μδ6) utsatt for glukose (1, 5 og 10 mM glukose). Data ble normalisert til de første 2 minuttene før glukoseeksponering. (C,D) Representative spor av det normaliserte signalet oppnådd fra FB som uttrykker laktatsensoren (C) eller pyruvatsensoren (D) utsatt for 0,1-0,5-1 mM laktat eller pyruvat. Dataene ble normalisert til de første 2 minuttene før laktat- eller pyruvateksponering. Forkortelser: FB = fett kropp; mTFP = monomert blågrønt fluorescerende protein; YFP = gult fluorescerende protein; CFP = cyan fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av Drosophila-modellen for studier av hjernemetabolisme er relativt ny26, og det har vist seg å dele flere egenskaper med pattedyrmetabolisme enn forventet, noe som primært har blitt studert in vitro i primære nevronkulturer eller hjerneskiver. Drosophila utmerker seg på in vivo-eksperimenter takket være batteriet av genetiske verktøy og genetisk kodede sensorer som gjør det mulig for forskere å visualisere i sanntid de metabolske endringene forårsaket av indusert aktivitet eller til og med som svar på en sensorisk stimulus.
Protokollen beskrevet her viser hvordan man måler monokarboksylat og glukosetransport i Drosophila VNC gliaceller og nevroner i et ex vivo-preparat som tillater bruk av genetisk kodede fluorescerende metabolske sensorer basert på FRET-mikroskopi for å lage time-lapse-videoer av metabolske endringer i hvilende og aktive nevroner. Denne protokollen kan enkelt monteres og utføres i et hvilket som helst laboratorium ved hjelp av Drosophila-modellen uten bruk av komplekst maskineri, ved hjelp av et epifluorescerende mikroskop utstyrt med et utslippssplittingssystem. Det kan også skaleres til mer avansert utstyr som en spinndisk, laser konfokal eller to-foton mikroskop (men en splitter for å dele lysutslippet er nødvendig) for å registrere bestemte celler dypere plassert i hjernen som forekommer i voksen Drosophila hjerne. Siden disse typer metabolske signaler er relativt langsomme, er det ikke nødvendig med et raskt eller dyrt videokamera.
I tillegg trenger det isolerte VNC- eller FB-preparatet ikke en sofistikert metode for bevegelseskorreksjon som noen ganger er nødvendig for in vivo-opptak . ImageJ plugins kan tilfredsstillende korrigere de fleste av bevegelsene til VNCs som produseres under eksperimentet. Som et resultat kan økningen i nevronaktivitet ved tilsetning av PTX eller tilsetning av relevante metabolitter utføres samtidig uten problemer forårsaket av naturlig kroppsmuskelkontraksjon, som sett i andre protokoller (som filetpreparatet)27.
Vi viser representative eksperimenter der laktat- og glukosetransport er tydelig observert ved fysiologisk relevante konsentrasjoner av disse metabolittene (henholdsvis 1 og 5 mM). Herfra forventes det at ethvert ukarakterisert gen eller tidligere rapportert protein kan testes for transportkapasitet under forskjellige forhold, for eksempel ved bruk av forskjellige modeller av nevrodegenerative sykdommer eller metabolske fornærmelser (høyt kaloriinnhold eller næringsbegrensning). I denne forbindelse viser vi at RNAi-mediert knockdown av en kjent monokarboksylattransportør reduserer laktattransport i gliaceller betydelig. Interessant nok er signalene hentet fra lakoniske og pyroniske sensorer svært følsomme for endringene i laktat eller pyruvat i mediet, noe som muliggjør en nøyaktig måling av de intracellulære endringene i disse metabolittene. Dette store dynamiske området av signalet ser ut til å være annerledes i pattedyrceller hvor et ikke-lineært forhold mellom signalet fra sensoren og den intracellulære laktatkonsentrasjonen er observert28.
Denne tilnærmingen kan gi svar på viktige aspekter om hvor og når monokarboksylater og glukose behandles eller utnyttes for å generere energi i hjernen under basal og høy nevronaktivitet. Økningen i nevronaktivitet forårsaket av PTX kan forårsake betydelige endringer i energirelaterte metabolitter, på samme måte som det som er sett i cellekulturer, hjernebilder og levende organismer23,24. Spesielt oppstår en økning i ATP-produksjonen minutter etter en økning i nevronaktivitet, mest sannsynlig på grunn av glukosemetabolisering og utveksling av laktat og pyruvat mellom gliaceller og nevroner, som tidligere rapportert17. Studien av behovene til spesifikke celler for tilførsel av glukose og monokarboksylater, samt mekanismene som ligger til grunn for transport eller generering, kan gjøres mulig ved å manipulere uttrykket av visse gener i forbindelse med bruk av genetisk kodede sensorer.
Andre metabolsk viktige vev kan lett binde seg til poly-L-lysinbelagte dekkslips og metabolittendringer avbildes i flere minutter. Nye transportører som medierer glukose- eller laktattransport i forskjellige vev kan studeres. Sirkulerende glukose transporteres for å produsere disakkaridet trehalose i larvefettlegemer via mekanismer som ikke er fullt ut forstått, disse metodene kan bidra til å bedre forstå denne banen. Videre, under næringsbegrensning, kan fettsyrer metaboliseres for å produsere ketonlegemer i FB, og transportørene som er nødvendige for å ekstrudere dem til hemolymfen er fortsatt ukjente.
Det er viktig å merke seg at denne protokollen kan brukes til å estimere akkumulering av en metabolitt over tid eller for å bestemme økningshastigheter i fluorescensen til en spesifikk sensor mellom forhold, men ikke å formelt vurdere endringer i "konsentrasjon" fordi dette ville kreve en in-situ sensorkalibrering. De mange cellelagene som utgjør VNC begrenser i dette tilfellet diffusjonen av molekyler, for eksempel ionoforer, som er nødvendige for denne kalibreringen. Vi anbefaler imidlertid å følge retningslinjer for bildebehandling som tillater kontrasterende laktatnivåer mellom forskjellige organer eller celler i et dyr29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmene av Sierralta Lab. Dette arbeidet ble støttet av FONDECYT-Iniciación 11200477 (til AGG) og FONDECYT Regular 1210586 (til JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glukosesensor) ble vennlig donert av Pierre-Yves Plaçais og Thomas Preat, CNRS-Paris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
