Summary
Здесь мы представляем протокол визуализации транспорта монокарбоксилатов, глюкозы и АТФ в глиальных клетках и нейронах с использованием генетически закодированных датчиков резонансной передачи энергии Фёрстера в препарате головного мозга личинки дрозофилы ex-vivo .
Abstract
Высокая потребность мозга в энергии из-за электрической активности является одной из его наиболее отличительных особенностей. Этим требованиям удовлетворяет производство АТФ из глюкозы и ее метаболитов, таких как монокарбоксилаты лактат и пируват. До сих пор неясно, как регулируется этот процесс и кто является ключевыми игроками, особенно в случае с дрозофилами.
Используя генетически закодированные датчики переноса энергии резонанса Фёрстера, мы представляем простой метод измерения транспорта монокарбоксилатов и глюкозы в глиальных клетках и нейронах в препарате головного мозга личинки дрозофилы ex-vivo . Протокол описывает, как препарировать и прикрепить мозг личинки, экспрессирующий один из датчиков, к стеклянному покровному стеклу.
Мы представляем результаты целого эксперимента, в котором транспорт лактата измерялся в мозге личинок путем сбивания ранее идентифицированных монокарбоксилатных транспортеров в глиальных клетках. Кроме того, мы демонстрируем, как быстро повысить нейронную активность и отслеживать метаболитные изменения в активном мозге. Описанный метод, дающий всю необходимую информацию, может быть использован для анализа других живых тканей дрозофилы .
Introduction
Мозг предъявляет высокие потребности в энергии из-за высоких затрат на восстановление ионных градиентов в нейронах, вызванных генерацией и передачей нейрональных электрических сигналов, а также синаптической передачей 1,2. Долгое время считалось, что эта высокая потребность в энергии удовлетворяется за счет непрерывного окисления глюкозы с образованиемАТФ3. Специфические транспортеры на гематоэнцефалическом барьере переносят глюкозу из крови в мозг. Постоянный уровень гликемии гарантирует, что мозг получает стабильное поступление глюкозы4. Интересно, что растущее количество экспериментальных данных свидетельствует о том, что молекулы, полученные в результате метаболизма глюкозы, такие как лактат и пируват, играют важную роль в выработке энергии клетками мозга 5,6. Тем не менее, до сих пор ведутся споры о том, насколько важны эти молекулы для производства энергии и какие клетки мозга производят илииспользуют их. Отсутствие соответствующих молекулярных инструментов с высоким временным и пространственным разрешением, необходимым для решения этой задачи, является существенной проблемой, которая помешала полностью разрешить этот спор.
Разработка и применение нескольких сконструированных флуоресцентных метаболических сенсоров привели к значительному улучшению нашего понимания того, где и как образуются и используются метаболиты, а также как возникают метаболические потоки во время базальной ивысокой активности нейронов. Генетически закодированные метаболические сенсоры, основанные на микроскопии резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET), такие как ATeam (АТФ), FLII12Pglu700μδ6 (глюкоза), Laconic (лактат) и Pyronic (пируват), внесли свой вклад в наше понимание энергетического метаболизма мозга 10,11,12,13. Однако из-за высокой стоимости и сложного оборудования, необходимого для проведения экспериментов на живых животных или тканях, результаты в моделях позвоночных по-прежнему в основном ограничиваются клеточными культурами (глиальными клетками и нейронами).
Новое использование модели дрозофилы для выражения этих сенсоров показало, что ключевые метаболические особенности сохраняются у разных видов, и их функции могут быть легко решены с помощью этого инструмента. Что еще более важно, модель дрозофилы пролила свет на то, как глюкоза и лактат/пируват транспортируются и метаболизируются в мозге мухи, на связь между потреблением монокарбоксилатов и формированием памяти, а также на замечательную демонстрацию того, как увеличение нейронной активности и метаболического потока перекрываются 14,15,16,17 . Представленный здесь метод измерения уровней монокарбоксилатов, глюкозы и АТФ с использованием генетически закодированных сенсоров FRET, экспрессируемых в мозге личинок, позволяет исследователям узнать больше о том, как мозг дрозофилы использует энергию, которая может быть применена к мозгу других животных.
Показано, что этот метод эффективен для обнаружения лактата и глюкозы в глиальных клетках и нейронах, и что монокарбоксилатный транспортер (Часки) участвует в импорте лактата в глиальные клетки. Мы также демонстрируем простой метод изучения метаболитных изменений при повышенной активности нейронов, которые могут быть легко индуцированы применением антагониста рецептора ГАМКА . Наконец, мы показываем, что эта методология может быть использована для измерения транспорта монокарбоксилатов и глюкозы в других метаболически значимых тканях, таких как жировые тела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поддержание штамма мух и синхронизация личинок
- Для проведения этих экспериментов использовали культуры мух, выращенные при температуре 25 °C, на стандартном корме дрозофилы , состоящем из 10% дрожжей, 8% глюкозы, 5% пшеничной муки, 1,1% агара, 0,6% пропионовой кислоты и 1,5% метилпарабена.
- Для следования этому протоколу используйте следующие строки: w1118 (экспериментальный контрольный фон), OK6-GAL4 (драйвер для двигательных нейронов), repo-GAL4 (драйвер для всех глиальных клеток), CG-GAL4 (драйвер для жировых тел), UAS-Pyronic (пируватный датчик), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (датчик глюкозы), UAS-Laconic (датчик лактата), UAS-GCaMP6f (датчик кальция), UAS-AT1.03NL (датчик АТФ) и UAS-Chk RNAi GD1829. Все линии, экспрессирующие сенсоры или РНК-интерференцию, находятся в генетическом фоне w1118 .
- Для получения синхронизированных блуждающих личинок третьего возраста помещают 300 мух (3-5 дней, 100 самцов, 200 девственных самок) желаемого генетического скрещивания в яйцекладочную камеру, содержащую 60-миллиметровую чашку Петри, покрытую 1%-ной агарозой в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Поместите каплю жидких/кремообразных дрожжей (диаметром 1,5 см) в центр бляшки, чтобы побудить мух откладывать яйца (рисунок 1).
- Держите мух при температуре 25 °C в течение 3 дней, заменяя агарозную чашку Петри свежей и свежерастворенными дрожжами два раза в день.
- Дайте мухам отложить яйца в течение 4 ч на четвертый день, прежде чем менять чашку Петри. Удалите этот налет. Затем в течение 3 ч дайте мухам отложить яйца в новый агарозный налет со свежерастворенными дрожжами. Используйте этих личинок в экспериментах.
- Через 3 ч удалите налет, содержащий яйца, и поместите его в инкубатор при температуре 25 °C на 24 часа.
- Соберите от 50 до 100 только что вылупившихся личинок из этой бляшки (через 0 ч после вылупления личинок) и поместите их в пластиковый флакон со стандартным кормом. Чтобы личинки могли нормально питаться, следите за тем, чтобы корм был измельченным и мягким. Используют личинки через 96 ч после пересадки.
2. Сделайте стеклянные покровные стекла с поли-L-лизином
- Выполните этот шаг за 1 ч до вскрытия личинки. В 6-луночный планшет для клеточных культур поместите стеклянные покровные стекла диаметром 25 мм (диаметр используемых крышек зависит от регистрирующей камеры, имеющейся в микроскопе).
- Поместите каплю (300 мкл) поли-L-лизина в центр каждого покровного стекла на 30 минут при комнатной температуре.
- Промойте каждый покровный листок 3 раза дистиллированной водой, затем 2 раза солевым раствором, лишенным Ca2+ (тот же раствор, который использовался для вскрытия личинок, см. шаг 3.2). Установите крышки в записывающую камеру и заполните ее солевым раствором, не содержащим Ca2+.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мозг личинки может прилипать непосредственно к стеклянным покровным стеклам, адгезия слабая, и мозг иногда перемещается или смещается во время эксперимента из-за непрерывного потока солевого раствора. Добавление поли-L-лизина снижает риск движений или даже потери мозга в результате стирки.
3. Рассечение вентрального нервного канатика (VNC) и жировых тел (FB)
- Соберите блуждающих личинок третьего возраста от желаемого генетического скрещивания (из шага 1.7) и тщательно промойте их 3 раза дистиллированной водой.
- Поместите личинок в стеклянную чашку для вскрытия, содержащую 750 мкл номинально нулевого Ca2+ ледяного солевого раствора, состоящего из 128 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES и 35 мМ сахарозы (рН = 6,7, измеренный рН-метром и скорректированный с 1 М NaOH и HCl 37% v/v).
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка рН на 6,7 имеет решающее значение, поскольку, как отмечалось ранее, перенос монокарбоксилатов сильно зависит от рН раствора. Кроме того, 6,7 соответствует рН в гемолимфе личинки третьего возраста17,18. - Поместите личинку под стереомикроскоп и сделайте поперечный надрез поперек задней части брюшка парой щипцов.
- Надавите щипцами на челюсть, выворачивая личинки наизнанку.
- Обратите внимание на вентральный нервный канатик (VNC) рядом с челюстью. Осторожно удалите имагинальные диски и оставшиеся мозгово-каудальные ткани.
- Отделите ВНК с центральным мозгом и долями зрительного нерва от остальной ткани, перерезав нервы. Перенесите VNC, подцепив его щипцами из оставшихся нервов, и поместите в записывающую камеру, содержащую записывающий раствор, свободный от Ca2+ (тот же раствор, что и на шаге 3.2). VNC сразу же прилипнут к покровным листкам.
- Чтобы избежать помех от оставшихся нервов, прикрепите их в нижней части покровного стекла с помощью щипцов (нервы также будут флуоресцентными в зависимости от используемой линии драйвера) (Рисунок 2).
- Чтобы провести эксперименты с жировыми телами (FB), измеряющими транспорт глюкозы или монокарбоксилатов в другой серии экспериментов, перейдите к изоляции тканей, выполнив шаги 3.1-3.4. После того, как личинки вывернуты наизнанку, обратите внимание, что FB представляет собой белую, двустороннюю, плоскую ткань.
- Изолированные FB, экспрессирующие датчики FRET (полученные от генетического скрещивания с использованием соответствующих драйверов), поместите в записывающую камеру, содержащую записывающий раствор без Ca2+.
ПРИМЕЧАНИЕ: FB обладает высокой гидрофобностью (имеет тенденцию плавать на поверхности раствора) и чрезвычайно уязвим к манипуляциям с щипцами, с ним необходимо обращаться осторожно. Любое грубое обращение с этой тканью приведет к появлению мертвых клеток в дальнейшем (с уменьшением флуоресценции сенсоров). - Поместите записывающую камеру, содержащую VNC/FB, на предметный столик микроскопа.
4. Визуализация живых клеток
- Для получения изображений тканей, экспрессирующих сенсоры, используйте вертикальный флуоресцентный микроскоп в сочетании с системой расщепления излучения и ПЗС-камерой. Включите систему подсветки микроскопа за 30 минут до начала любого эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем флуоресцентный микроскоп с вращающимся диском, оснащенный объективом для погружения в воду 20x/0,5, для наблюдения как VNC, так и FB. На рисунке 2 также показано использование объектива для погружения в воду 40x/0,8. - Чтобы визуализировать флуоресценцию GCaMP6f, установите длины волн возбуждения и излучения на длине волны 488 нм и 540 нм соответственно. Для лаконических/пиронических/АТФ/глюкозных датчиков установите длину волны возбуждения 440 нм и длину волны излучения 488 нм (mTFP, CFP) и 540 нм (Venus, YFP).
- Получение изображений размером 512 x 512 пикселей каждые 2 с для GCaMP6f и каждые 10-30 с для Laconic/Pyronic/ATP/глюкозных датчиков. Определите оптимальную экспозицию источника света, наблюдая за качеством получаемого изображения. Чтобы следовать этому протоколу, убедитесь, что изображения имеют выдержку 300 мс для сенсоров Laconic и Pyronic и 100-150 мс для датчиков глюкозы и АТФ .
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспозиция может варьироваться в зависимости от использования конфокального или обычного флуоресцентного микроскопа. - После того, как регистрирующая камера установлена на предметном столике микроскопа, осторожно поместите объектив для погружения в воду и убедитесь, что объектив остается погруженным в воду на протяжении всего эксперимента. Поддерживайте температуру в помещении на уровне 25 °C.
- Подключите регистрирующую камеру к перфузионной системе и держите ткани в регистрирующем растворе, содержащем 128 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1,5 мМ CaCl2, 4 мМ MgCl2, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES и 35 мМ сахарозы, pH 6,7 (измерено рН-метром и скорректировано с помощью NaOH и HCl).
- Поддерживайте постоянный поток регистрирующего раствора 3 мл/мин через ткань с помощью силы тяжести в сочетании с перистальтическим насосом с низким потоком для извлечения жидкости из камеры, сохраняя постоянный объем. Для достижения требуемого расхода расположите пробирки с раствором (пластиковые пробирки объемом 50 мл) на высоте 25 см над столиком микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот поток, управляемый гравитацией, используется для предотвращения движения тканей, вызванного перистальтическими насосами, что позволяет проводить более точный анализ изображений в дальнейшем. - Перед любой стимуляцией поддерживайте поток записывающего раствора в течение 5-10 минут, чтобы получить стабильный базовый уровень флуоресценции от датчиков. При необходимости измените длительность, чтобы получить этот базовый план.
- Замените проточный раствор раствором для стимуляции на 5 мин для стимуляции VNC/FB (глюкозой, пируватом или лактатом в концентрации, описанной для каждого эксперимента, растворенным в физиологическом растворе; см. каждый рисунок).
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность стимуляции может варьироваться в соответствии с потребностями эксперимента (например, импульсы глюкозы могут быть увеличены до 10 мин для достижения плато в нейронах, как сообщалось ранее16). - Чтобы сохранить осмолярность в стимулирующем растворе, выпрямите концентрацию сахарозы (углевода, не метаболизируемого мозгом дрозофилы ) в соответствии с концентрацией добавленного монокарбоксилата или глюкозы.
- Меняйте растворы с помощью простой системы клапанов. Будьте осторожны и не перемещайте предметный столик микроскопа.
- Подвергните VNC воздействию пикротоксина 80 мкМ (PTX, непрерывно текущего) для стимуляции нейрональной активности. Эта процедура увеличивает частоту осцилляцийCa2+ , что позволяет наблюдать изменения в метаболически значимых молекулах (например, внутриклеточной АТФ).
- В конце любого эксперимента тщательно промывайте всю проточную систему, включая пробирки и регистрирующую камеру, в течение не менее 10 минут физиологическим раствором и еще 10 минут дистиллированной водой, чтобы удалить любые следы используемых растворов.
5. Обработка изображений и анализ данных
- Для обработки полученных изображений выполните шаги, показанные на рисунке 3.
- Импортируйте изображение (Laconic) в программу ImageJ. На изображении изображен два вида образца: слева — сигнал mTFP, а справа — сигнал Венеры. Выберите область, содержащую анализируемые ячейки, и разделите эти изображения (mTFP и Venus) в новом окне. Убедитесь, что эти изображения содержат одну и ту же область.
- Откройте плагин регистрации и исправьте небольшой дрейф ткани, который обычно наблюдается в эксперименте с функцией твердого тела. Выполните это на обоих изображениях (mTFP и Venus).
- Выберите не менее 10 областей интереса (ROI) в цитозоле соответствующих 10 клеток в сигнале mTFP (488 нм) и перенесите эти выделения на изображение Венеры (540 нм).
- Выберите два или три ROI близко к анализируемым клеткам, но без различимого сигнала (всегда в пределах VNC или анализируемой ткани, см. рис. 3). Это фоновые ROI.
- Выбрав ROI на обоих изображениях, получите среднее значение серого для каждого сигнала с помощью функции measure. Перенесите данные в даташит и вычтите среднее значение фона для каждого сигнала.
- Определите коэффициент флуоресценции mTFP над Венерой (для Laconic и Pyronic). Это значение вычисляется иначе, чем другие датчики FRET, описанные здесь (где соотношение обычно составляет YFP/CFP), потому что при привязке к соответствующим подложкам и Laconic, и Pyronic снижают эффективность FRET.
- Нормализуйте данные, разделив каждое записанное значение на базовый план. В отдельном информационном листе рассчитайте исходный уровень, взяв среднее значение соотношения mTFP/Венера в течение 2 минут, предшествующих стимулу.
- Для измерений уровня глюкозы и АТФ с помощью датчиков на основе FRET рассчитайте соотношение YFP/CFP и нормализуйте данные, как описано в шаге 5.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В течение 1 ч эта процедура позволяет легко измерять внутриклеточные изменения флуоресценции монокарбоксилатных и глюкозных сенсоров. Как показано на рисунке 4, лаконичные сенсоры как в глиальных клетках, так и в двигательных нейронах реагируют на лактат 1 мМ с одинаковой скоростью в начале импульса, но двигательные нейроны достигают более высокого увеличения по сравнению с исходным уровнем в течение 5-минутного импульса,как было продемонстрировано ранее. Эта концентрация лактата была выбрана потому, что она сопоставима с уровнями, обнаруженными в гемолимфе личинок третьего возраста. Аналогичным образом, когда VNC-экспрессирующие датчики глюкозы подвергались воздействию глюкозы 5 мМ (значение, аналогичное тому, которое мы и другие измеряли в гемолимфе19), сигнал датчика увеличивался с той же скоростью в глиальных клетках и нейронах. Однако во время импульса глюкозы сигнал в нейронах увеличивается больше, чем в глиальных клетках. Это согласуется с предыдущими наблюдениями за аналогичными препаратами, экспрессирующими датчики FRET,16.
Этот препарат может быть использован для проведения экспериментов с неописанными монокарбоксилатами и транспортерами глюкозы, экспрессируемыми в глиальных клетках или нейронах дрозофилы 20. Здесь мы проиллюстрировали использование РНК-интерференции, чтобы показать, что Chaski (Chk), который, как было известно ранее, транспортирует монокарбоксилаты в гетерологичных клетках, транспортирует лактат в глиальных клетках (рис. 5). В условиях ограничения питания этот переносчик играл важную роль в физиологии и поведении животных21. Мы обнаружили, что в глиальных клетках нокаут Chk снижал транспорт лактата по сравнению с контрольными VNC, подвергшимися воздействию лактата 1 мМ (рис. 5). Другие предполагаемые переносчики могут быть протестированы, чтобы увидеть, могут ли они транспортировать метаболиты в физиологических и патологических условиях.
Для изучения метаболических изменений, связанных с нейронной активностью, мы разработали простой метод увеличения нейрональной активности без использования технически сложных процедур, таких как оптогенетика, которые могут мешать измерениям датчика FRET (рис. 6). Изолированный VNC подвергался воздействию пикротоксина (PTX), известного антагониста рецепторовГАМК А, ранее использовавшегося нами и другими17,22. Используемая концентрация увеличивает частоту осцилляций кальция в нейронах (измеряемую изменениями флуоресценции GCaMP6f), а также значительные изменения в метаболически значимых молекулах, таких как глюкоза, лактат и пируват17. Кроме того, индуцированное ПТХ повышение активности нейронов приводит к временному падению уровня АТФ в соме двигательных нейронов. Это явление ранее было описано в моделях позвоночных, в которых активность нейронов увеличивалась с помощью электрической стимуляции или с помощью антагонистов рецепторовГАМК А 23,24. В результате, эта модель может быть использована для отслеживания метаболических изменений в определенных подмножествах нейронов и глиальных клеток, удовлетворяя потребность в связанных с энергией транспортерах, которые способствуют выработке АТФ во время высокой активности нейронов.
Транспорт глюкозы и монокарбоксилатов также важен в тканях или клетках, отличных от мозга. Мы показываем здесь визуализацию монокарбоксилата (лактата/пирувата) и поглощения глюкозы жировыми телами, метаболически значимой тканью, присутствующей в личинках и взрослой мухе, которая выполняет несколько ключевых функций, таких как хранение и метаболизм липидов25. Сенсор Laconic хорошо выражен в FB, как показано на рисунке 7, где липидные капли можно увидеть в виде крошечных черных сфер внутри клетки. Эта изолированная ткань хорошо прилипает к покрывающим стеклам, покрытым поли-L-лизином, что позволяет проводить длительную процедуру визуализации клеток, которую также легко анализировать. Мы наблюдали значительное увеличение флуоресценции датчика глюкозы при воздействии ФБ на повышение концентрации глюкозы (примерно 5 мМ), что близко к концентрации глюкозы, обнаруженной в гемолимфе. Дальнейшее воздействие более высоких концентраций глюкозы (10 мМ) не приводит к ожидаемому увеличению флуоресценции сенсора. Наконец, в FB мы смогли измерить импорт лактата и пирувата (рис. 7C, D). При этом увеличение концентраций лактата и пирувата вызывает пропорциональное увеличение лаконической и пироновой флуоресценции (в пределах от 0,1 до 1 мМ). Более высокие концентрации монокарбоксилатов приводят к насыщению сигналом внутри клеток.
Рисунок 1: Синхронизация личинок дрозофилы . Процедура синхронизации личинок изображена графически. За два часа до начала процесса 1% агарозные планшеты необходимо подготовить и менять два раза в день до 4 дня. Вылупившихся личинок необходимо собирать с осторожностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изолированный мозг личинки дрозофилы , экспрессирующий лактатный сенсор Laconic. (А) Репрезентативное изображение изолированной ВНК личинки дрозофилы третьего возраста, прикрепленной к покрытому поли-L-лизином покровному покрытию и экспрессирующей лактатный сенсор Laconic в мотонейронах (OK6-GAL4). На изображениях показано светлопольное изображение VNC (слева) и флуоресценции mTFP датчика (средняя панель), полученное с помощью объектива с 20-кратным погружением в воду. Изображения на нижней панели представляют собой тот же VNC, снятый с помощью 40-кратного объектива для погружения в воду. (B) Двигательные нейроны из VNC, экспрессирующие сенсор лактата Laconic (OK6>Laconic), помещенные в физиологический раствор с нулевым содержанием лактата. На изображении показана флуоресценция mTFP (слева), флуоресценция Венеры (в центре) и соотношение между двумя флуоресценциями (справа, полученное с помощью плагина Ratio Plus программного обеспечения ImageJ). Масштабные линейки = 50 мкм (А, верхняя панель), 10 мкм (А , нижняя панель, В). Сокращения: VNC = вентральный нервный канатик; mTFP = мономерный бирюзовый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пошаговый анализ изображений. Схематическое изображение программного протокола ImageJ для анализа изображений, отображающее процесс (первый столбец), команды ImageJ (второй столбец) и результаты обработки изображений (третий столбец). Пример начинается с необработанного изображения, полученного с VNC, экспрессирующего сенсор лактата Laconic в двигательных нейронах (OK6-GAL4). Сокращения: VNC = вентральный нервный канатик; mTFP = мономерный бирюзовый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Монокарбоксилатный транспорт и транспорт глюкозы в нейронах и глиальных клетках головного мозга личинок дрозофилы . (А) Репрезентативные изображения VNC, экспрессирующего лактатный сенсор Laconic в мотонейронах (OK6-Gal4>Laconic). Лаконичная флуоресценция в мотонейронах наблюдается до, во время и после 5-минутного импульса 1 мМ лактата. Для создания изображений пропорций (mTFP/Venus) использовался плагин Ratio Plus от ImageJ. Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Репрезентативные записи сигналов FRET от изолированных VNC, экспрессирующих лаконичный датчик лактата, в двигательных нейронах (OK6-GAL4, серые линии) или глиальных клетках (REPO-GAL4, черные линии), подвергшихся воздействию лактата 1 мМ в течение 5 мин. На трассах отображаются скорректированные сигналы FRET до среднего значения, собранного за 2 мин до экспозиции лактата. (C) Репрезентативные записи сигналов FRET от изолированных VNC, экспрессирующих датчик глюкозы FLII12Pglu700μδ6 в двигательных нейронах (OK6-GAL4, серые линии) или глиальных клетках (REPO-GAL4, черные линии) при воздействии 5 мМ глюкозы в течение 5 мин. На трассах отображаются скорректированные сигналы FRET до среднего значения, полученного за две минуты до воздействия глюкозы. Сокращения: VNC = вентральный нервный канатик; mTFP = мономерный бирюзовый флуоресцентный белок; FRET = резонансная передача энергии Фёстера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Транспорт лактата в глиальных клетках головного мозга личинок дрозофилы, экспрессирующих РНК Часки. (А) Изолированные VNC, экспрессирующие лактатный сенсор Лаконичный в одиночку (генетический контроль, w1118, черная линия) или совместно экспрессирующие РНК-интерференцию для подавления экспрессии Chaski (Chk) (chk-RNAi, пурпурный), подвергались воздействию 1 мМ лактата в течение 5 мин. Для каждого условия трассы представляют собой среднее значение FRET, полученное из семи отдельных VNC (70 клеток на условие, нормализованное с использованием среднего значения, полученного за 2 мин до воздействия лактата). (В) Площадь под кривой в А используется для расчета внутриклеточного накопления лактата. Для каждого условия значениями являются среднее значение SE из 70 клеток и семи независимых экспериментов (контрольных или chk-RNAi). Для статистического анализа использовали непарный t-критерий Стьюдента (*p < 0,05). Сокращения: VNC = вентральный нервный канатик; FRET = резонансная передача энергии Фёстера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изменения уровня АТФ в нейронах, вызванные воздействием пикротоксина. Записи флуоресценции, полученной от VNC, экспрессирующих генетически кодируемый (A) кальциевый сенсор GCaMP6f или (B, другой набор экспериментов) АТФ-сенсора AT1.03NL в мотонейронах (OK6-GAL4), которые подвергались воздействию антагониста рецептораГАМК А пикротоксина (80 мкМ) в течение времени, указанного линией. Репрезентативная запись поступает от одного двигательного нейрона из VNC (в А) или от среднего ± SE из 10 клеток из одного VNC (в B), нормализованного к средним значениям, полученным за 2 мин до воздействия PTX. Сокращения: VNC = вентральный нервный канатик; PTX = пикротоксин; SE = стандартная ошибка; CFP = голубой флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Транспорт монокарбоксилатов и глюкозы в жировых телах дрозофилы . (А) Изображение изолированного жирового тела от личинок третьего возраста, экспрессирующих лактатный сенсор Лаконичность (флуоресценция mTFP). Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Репрезентативные следы нормализованного сигнала, захваченного в FB, экспрессирующего датчик глюкозы (FLII12Pglu700μδ6) при воздействии глюкозы (1, 5 и 10 мМ глюкозы). Данные были нормализованы до первых 2 мин до воздействия глюкозы. (С,Д) Репрезентативные следы нормализованного сигнала, полученного от FB, экспрессирующего датчик лактата (C) или пируватный сенсор (D) при воздействии 0,1-0,5-1 мМ лактата или пирувата. Данные были нормализованы до первых 2 мин до воздействия лактата или пирувата. Сокращения: FB = жировое тело; mTFP = мономерный бирюзовый флуоресцентный белок; YFP = желтый флуоресцентный белок; CFP = голубой флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование модели дрозофилы для изучения метаболизма мозга являетсяотносительно новым, и было показано, что она имеет больше общих характеристик с метаболизмом млекопитающих, чем ожидалось, который в основном изучался in vitro в культурах первичных нейронов или срезах мозга. Дрозофила преуспевает в экспериментах in vivo благодаря батарее генетических инструментов и генетически закодированных сенсоров, которые позволяют исследователям визуализировать в режиме реального времени метаболические изменения, вызванные индуцированной активностью или даже в ответ на сенсорный стимул.
Протокол, описанный здесь, показывает, как измерять монокарбоксилатный транспорт и транспорт глюкозы в глиальных клетках и нейронах дрозофилы VNC в препарате ex-vivo , который позволяет использовать генетически кодируемые флуоресцентные метаболические сенсоры на основе микроскопии FRET для создания покадровых видео метаболических изменений в покоящихся и активных нейронах. Этот протокол может быть легко смонтирован и проведен в любой лаборатории с использованием модели дрозофилы без использования сложного оборудования, с использованием эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного системой расщепления излучения. Он также может быть масштабирован до более продвинутого оборудования, такого как вращающийся диск, лазерный конфокальный или двухфотонный микроскоп (но требуется разветвитель для разделения светового излучения) для записи определенных клеток, расположенных глубже в мозге, как это происходит в мозге взрослой дрозофилы . Поскольку эти типы метаболических сигналов относительно медленные, быстрая или дорогая видеокамера не нужна.
Кроме того, изолированная препарация VNC или FB не требует сложного метода коррекции движения, который иногда требуется для записей in vivo . Плагины ImageJ могут удовлетворительно корректировать большинство движений VNC, которые производятся во время эксперимента. В результате, увеличение активности нейронов за счет добавления PTX или соответствующих метаболитов может быть выполнено одновременно без проблем, вызванных естественным сокращением мышц тела, как это видно в других протоколах (например, при подготовке филе)27.
Показаны репрезентативные эксперименты, в которых отчетливо прослеживается транспорт лактата и глюкозы при физиологически значимых концентрациях этих метаболитов (1 и 5 мМ соответственно). Отсюда ожидается, что любой неохарактеризованный ген или ранее зарегистрированный белок может быть протестирован на транспортную способность в различных условиях, таких как использование различных моделей нейродегенеративных заболеваний или метаболических нарушений (высококалорийные диеты или ограничение питательных веществ). В связи с этим показано, что РНК-опосредованный нокдаун известного монокарбоксилатного транспортера значительно снижает транспорт лактата в глиальных клетках. Интересно, что сигналы, получаемые от сенсоров Laconic и Pironic, очень чувствительны к изменениям лактата или пирувата в средах, что позволяет точно измерять внутриклеточные изменения в этих метаболитах. Этот обширный динамический диапазон сигнала, по-видимому, отличается в клетках млекопитающих, где наблюдалась нелинейная зависимость между сигналом сенсора и внутриклеточной концентрацией лактата28.
Этот подход может дать ответы на важные аспекты о том, где и когда монокарбоксилаты и глюкоза перерабатываются или используются для генерации энергии в мозге во время базальной и высокой активности нейронов. Увеличение нейронной активности, вызванное PTX, может вызвать значительные изменения в метаболитах, связанных с энергией, аналогично тому, что наблюдалось в клеточных культурах, предметных стеклах мозга и живых организмах23,24. В частности, всплеск выработки АТФ происходит через несколько минут после увеличения активности нейронов, скорее всего, из-за метаболизма глюкозы и обмена лактата и пирувата между глиальными клетками и нейронами,как сообщалось ранее. Изучение потребностей специфических клеток в снабжении глюкозой и монокарбоксилатами, а также механизмов, лежащих в основе их транспорта или генерации, может стать возможным благодаря манипулированию экспрессией определенных генов в сочетании с использованием генетически кодируемых сенсоров.
Другие метаболически важные ткани могут легко связываться с покрывающими стеклами, покрытыми поли-L-лизином, и изменения метаболитов можно визуализировать в течение нескольких минут. Могут быть изучены новые транспортеры, опосредующие транспорт глюкозы или лактата в различных тканях. Циркулирующая глюкоза транспортируется для производства дисахарида трегалозы в жировых телах личинок с помощью механизмов, которые не до конца изучены, эти методы могут помочь лучше понять этот путь. Кроме того, при ограничении питательных веществ жирные кислоты могут метаболизироваться с образованием кетоновых тел в FB, а транспортеры, необходимые для их экструдирования в гемолимфу, до сих пор неизвестны.
Важно отметить, что этот протокол может быть использован для оценки накопления метаболита с течением времени или для определения скорости увеличения флуоресценции конкретного датчика между условиями, но не для формального учета изменений «концентрации», поскольку это потребовало бы калибровки датчика на месте. Несколько клеточных слоев, составляющих VNC, в этом случае ограничивают диффузию молекул, таких как ионофоры, необходимые для этой калибровки. Тем не менее, мы рекомендуем следовать рекомендациям по обработке изображений, которые позволяют сравнивать уровни лактата между различными органами или клетками животного29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим всех сотрудников Sierralta Lab. Эта работа была поддержана FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGG) и FONDECYT Regular 1210586 (JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (датчик глюкозы) был любезно предоставлен Пьером-Ивом Пласе (Pierre-Yves Plaçais) и Томасом Преатом (Thomas Preat), CNRS-Paris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
