Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לדמיין את ההובלה של מונוקרבוקסילטים, גלוקוז ו- ATP בתאי גלייה ונוירונים באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo .
Abstract
דרישות האנרגיה הגבוהות של המוח עקב פעילות חשמלית הן אחת התכונות הבולטות ביותר שלהם. דרישות אלה נפגשות על ידי ייצור ATP מגלוקוז ומטבוליטים שלו, כגון monocarboxylates לקטט ו pyruvate. עדיין לא ברור כיצד תהליך זה מוסדר או מי הם שחקני המפתח, במיוחד בדרוזופילה.
באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית, אנו מציגים שיטה פשוטה למדידת ההובלה של מונוקרבוקסילטים וגלוקוז בתאי גלייה ובתאי עצב בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo . הפרוטוקול מתאר כיצד לנתח ולהצמיד מוח זחל המבטא את אחד החיישנים לכיסוי זכוכית.
אנו מציגים תוצאות של ניסוי שלם שבו העברת לקטט נמדדה במוחות של זחלים על ידי הפלת טרנספורטרים מונוקרבוקסילטים שזוהו בעבר בתאי גלייה. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד להגביר במהירות את הפעילות העצבית ולעקוב אחר שינויים מטבוליטים במוח הפעיל. השיטה המתוארת, המספקת את כל המידע הדרוש, יכולה לשמש לניתוח רקמות חיות אחרות של דרוזופילה .
Introduction
למוח יש דרישות אנרגיה גבוהות בשל העלות הגבוהה של שחזור שיפועי יונים בנוירונים הנגרמים על ידי ייצור ושידור אותות חשמליים עצביים, כמו גם שידור סינפטי 1,2. דרישה גבוהה זו לאנרגיה נחשבת מזה זמן רב כמסופקת על ידי חמצון מתמשך של גלוקוז לייצור ATP3. טרנספורטרים ספציפיים במחסום הדם-מוח מעבירים את הגלוקוז בדם למוח. רמות גליקמיות קבועות מבטיחות שהמוח יקבל אספקה קבועה של גלוקוז4. באופן מעניין, עדויות ניסיוניות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמולקולות שמקורן במטבוליזם של גלוקוז, כגון לקטט ופירובט, ממלאות תפקיד חשוב בייצור האנרגיה של תאי המוח 5,6. עם זאת, עדיין יש ויכוח על כמה חשובות מולקולות אלה לייצור אנרגיה ואילו תאים במוח מייצרים או משתמשים בהם 7,8. היעדר כלים מולקולריים מתאימים ברזולוציה הטמפורלית והמרחבית הגבוהה הנדרשת למשימה זו הוא נושא משמעותי שמנע ממחלוקת זו להיפתר לחלוטין.
הפיתוח והיישום של מספר חיישנים מטבוליים פלואורסצנטיים מהונדסים הביאו לעלייה יוצאת דופן בהבנה שלנו היכן וכיצד מטבוליטים מיוצרים ומשמשים אותם, כמו גם כיצד השטפים המטבוליים מתרחשים במהלך פעילות עצבית בסיסית וגבוהה9. חיישנים מטבוליים מקודדים גנטית המבוססים על מיקרוסקופ Förster resonance energy transfer (FRET), כגון ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (גלוקוז), לקוני (לקטט) ופירוני (פירובט), תרמו להבנתנו את חילוף החומרים של אנרגיית המוח 10,11,12,13. עם זאת, בשל העלויות הגבוהות והציוד המשוכלל הנדרש לביצוע ניסויים בבעלי חיים או ברקמות, התוצאות במודלים של בעלי חוליות עדיין מוגבלות בעיקר לתרביות תאים (תאי גלייה ונוירונים).
השימוש המתפתח במודל דרוזופילה כדי לבטא חיישנים אלה גילה כי תכונות מטבוליות מרכזיות נשמרות בין מינים שונים וניתן לטפל בתפקודם בקלות באמצעות כלי זה. חשוב מכך, מודל דרוזופילה שפך אור על האופן שבו גלוקוז ולקטט/פירובט מועברים ועוברים מטבוליזם במוח הזבוב, על הקשר בין צריכת מונוקרבוקסילט והיווצרות זיכרון, ועל ההדגמה המדהימה של האופן שבו עלייה בפעילות העצבית ובשטף המטבולי חופפים 14,15,16,17. השיטה המוצגת כאן למדידת רמות מונוקרבוקסילט, גלוקוז ו- ATP באמצעות חיישני FRET מקודדים גנטית המבוטאים במוח הזחל מאפשרת לחוקרים ללמוד יותר על האופן שבו המוח של דרוזופילה משתמש באנרגיה, אשר יכולה להיות מיושמת במוחות של בעלי חיים אחרים.
אנו מראים כי שיטה זו יעילה לאיתור לקטט וגלוקוז בתאי גלייה ובנוירונים, וכי טרנספורטר מונוקרבוקסילט (צ'אסקי) מעורב ביבוא לקטט לתאי גלייה. אנו גם מדגימים שיטה פשוטה לחקר שינויים מטבוליטים במהלך פעילות עצבית מוגברת, אשר ניתן לגרום בקלות על ידי יישום אמבטיה של אנטגוניסט קולטן GABAA . לבסוף, אנו מראים כי מתודולוגיה זו יכולה לשמש למדידת מונוקרבוקסילט והובלת גלוקוז ברקמות משמעותיות מטבולית אחרות, כגון גופי שומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחזוקת זבובים וסנכרון זחלים
- כדי לבצע ניסויים אלה, השתמשו בתרביות זבובים שגודלו בטמפרטורה של 25°C על מזון דרוזופילה סטנדרטי המורכב מ-10% שמרים, 8% גלוקוז, 5% קמח חיטה, 1.1% אגר, 0.6% חומצה פרופיונית ו-1.5% מתילפרבן.
- כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בשורות הבאות: w1118 (רקע בקרה ניסיונית), OK6-GAL4 (מנהל התקן עבור נוירונים מוטוריים), repo-GAL4 (מנהל התקן עבור כל תאי גלייה), CG-GAL4 (מנהל התקן עבור גופים שמנים), UAS-Pyronic (חיישן פירובט), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (חיישן גלוקוז), UAS-Laconic (חיישן לקטט), UAS-GCaMP6f (חיישן סידן), UAS-AT1.03NL (חיישן ATP) ו- UAS-Chk RNAi GD1829. כל הקווים המבטאים חיישנים או RNAi נמצאים ברקע הגנטי w1118 .
- כדי להשיג זחלים נודדים מסונכרנים של כוכב שלישי, הניחו 300 זבובים (בני 3-5 ימים, 100 זכרים, 200 נקבות בתולות) של הצלב הגנטי הרצוי בתא הטלת הביצים, המכיל צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכוסה באגרוז 1% בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). הניחו טיפת שמרים נוזליים/קרמיים (בקוטר 1.5 ס"מ) במרכז הפלאק כדי לעודד זבובים להטיל ביצים (איור 1).
- שמור את הזבובים על 25 ° C במשך 3 ימים החלפת צלחת פטרי agarose עם אחד טרי שמרים מומסים פעמיים ביום.
- אפשרו לזבובים להטיל ביצים במשך 4 שעות ביום הרביעי לפני החלפת צלחת הפטרי. הסר לוחית זו. לאחר מכן, במשך 3 שעות, לאפשר לזבובים להטיל ביצים בלוח אגרוז חדש עם שמרים מומסים טריים. השתמשו בזחלים האלה בניסויים.
- לאחר 3 שעות, להסיר את הפלאק המכיל את הביצים ומניחים אותו באינקובטור 25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
- אספו 50 עד 100 זחלים שזה עתה בקעו מלוח זה (0 שעות לאחר בקיעת הזחל) והניחו אותם בבקבוקון פלסטיק המכיל מזון סטנדרטי. כדי לאפשר לזחלים להאכיל כראוי, ודאו שהמזון טחון ורך. השתמש בזחלים 96 שעות לאחר ההעברה.
2. הכינו את כיסויי הזכוכית עם פולי-L-ליזין
- בצע שלב זה 1 שעות לפני נתיחת הזחל. בלוח תרבית תאים בן 6 בארות, מניחים כיסויי זכוכית בקוטר 25 מ"מ (קוטר הכיסויים לשימוש תלוי בתא ההקלטה הזמין במיקרוסקופ).
- יש להניח טיפה (300 μL) של פולי-L-ליזין במרכז כל כיסוי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף כל כיסוי 3x במים מזוקקים, ולאחר מכן 2x בתמיסת מלח נטולת Ca2+ (אותה תמיסה המשמשת לניתוח הזחלים, ראה שלב 3.2). התקן את הכיסויים בתא ההקלטה ומלא אותו בתמיסת מלח ללא Ca2+.
הערה: למרות שמוח הזחל יכול להיצמד ישירות לכיסויי הזכוכית, ההיצמדות חלשה, והמוח מדי פעם זז או זז במהלך הניסוי עקב זרימה רציפה של תמיסת מלח. הוספת שלב הפולי-ל-ליזין מפחיתה את הסיכון לתנועות או אפילו לאובדן מוחי כתוצאה מהשטיפות.
3. לנתח את חוט העצבים הגחוני (VNC) ואת גופי השומן (FBs)
- אספו את הזחלים הנודדים מהצלב הגנטי הרצוי (משלב 1.7) ושטפו אותם ביסודיות 3 פעמים במים מזוקקים.
- הניחו את הזחלים בכלי דיסקציה מזכוכית המכיל 750 מיקרוליטר של אפס נומינלי Ca2+ תמיסת מלח קרה כקרח המורכבת מ-128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES ו-35 mM סוכרוז (pH = 6.7, נמדד עם מד pH והותאם עם 1 M NaOH ו-HCl 37% v/v).
הערה: הגדרת ה- pH ל- 6.7 היא קריטית מכיוון שכפי שנצפה בעבר, הובלת מונוקרבוקסילט תלויה מאוד ב- pH של התמיסה. בנוסף, 6.7 מתאים ל- pH בהמולימפה של זחל כוכב שלישי17,18. - מניחים את הזחל מתחת לסטריאומיקרוסקופ ומבצעים חתך רוחבי לאורך החלק האחורי של הבטן עם זוג מלקחיים.
- דחפו את הלסת עם המלקחיים תוך כדי הפיכת הזחלים מבפנים החוצה.
- שימו לב לחוט העצב הגחוני (VNC) ליד הלסת. בזהירות להסיר את הדיסקים הדמיוניים ואת רקמות המוח הנותרות.
- להפריד את VNC עם המוח המרכזי ואת האונות האופטיות משאר הרקמה על ידי חיתוך העצבים. העבירו את ה-VNC, הרימו אותו עם מלקחיים מהעצבים הנותרים, והניחו אותו בתא ההקלטה המכיל את תמיסת ההקלטה נטולת Ca2+ (אותו פתרון משלב 3.2). ה-VNCs ידבקו מיד בכיסויים.
- כדי למנוע הפרעה מהעצבים הנותרים, חברו אותם בתחתית הכיסוי באמצעות מלקחיים (העצבים יהיו גם פלואורסצנטיים בהתאם לקו הנהג שבו משתמשים) (איור 2).
- כדי לבצע ניסויים בגופי שומן (FBs) המודדים הובלת גלוקוז או מונוקרבוקסילט בסדרה אחרת של ניסויים, המשיכו לבודד את הרקמות בעקבות שלבים 3.1-3.4. ברגע שהזחלים הופכים מבפנים החוצה, שימו לב שה-FB הוא רקמה לבנה, דו-צדדית ושטוחה.
- מקם את ה- FBs המבודדים המבטאים את חיישני FRET (המתקבלים מצלב גנטי באמצעות מנהלי ההתקן המתאימים) בתא ההקלטה המכיל את פתרון ההקלטה ללא Ca2+.
הערה: ה- FB הוא הידרופובי מאוד (הוא נוטה לצוף על פני השטח של התמיסה) ופגיע מאוד למניפולציה עם מלקחיים, יש לטפל בו בזהירות. כל טיפול גס ברקמה זו יגרום לתאים מתים מאוחר יותר (עם ירידה בפלואורסצנטיות של החיישנים). - הניחו את תא ההקלטה המכיל VNCs/FBs על במת המיקרוסקופ.
4. הדמיה חיה של תאים
- כדי לקבל תמונות של חיישני ביטוי הרקמה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף המחובר למערכת פיצול פליטה ומצלמת CCD. הפעל את מערכת התאורה של המיקרוסקופ 30 דקות לפני תחילת כל ניסוי.
הערה: כאן אנו משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי של דיסק מסתובב המצויד במטרה של טבילת מים 20x/0.5 כדי לצפות הן ב-VNCs והן ב-FBs. איור 2 מראה גם את השימוש ביעד טבילה במים של 40x/0.8. - כדי להמחיש פלואורסצנטיות GCaMP6f, הגדר את אורכי גל העירור והפליטה על 488 ננומטר ו- 540 ננומטר, בהתאמה. עבור חיישנים לקוניים/פירוניים/ATP/גלוקוז, הגדר את אורך גל העירור ל-440 ננומטר ואת אורכי גל הפליטה ל-488 ננומטר (mTFP, CFP) ו-540 ננומטר (נוגה, YFP).
- קבל תמונות בגודל 512 x 512 פיקסלים כל 2 שניות עבור GCaMP6f וכל 10-30 שניות עבור חיישנים לקוניים/פירוניים/ATP/גלוקוז. קבע את החשיפה האופטימלית למקור האור תוך התבוננות באיכות התמונה המתקבלת. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, ודא שהתמונות הן של חשיפה של 300 אלפיות השנייה עבור חיישנים לקוניים ופירוניים ו- 100-150 מילישניות עבור חיישני הגלוקוז וה- ATP.
הערה: החשיפה עשויה להשתנות בהתאם לשימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי או רגיל. - לאחר התקנת תא ההקלטה בשלב המיקרוסקופ, מקמו בזהירות את מטרת טבילת המים וודאו שהמטרה נשארת שקועה לאורך כל הניסוי. שמור על טמפרטורת החדר על 25 °C.
- חבר את תא ההקלטה למערכת זילוח ושמור על הרקמות שטופות בתמיסת הקלטה המכילה 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES ו- 35 mM סוכרוז, pH 6.7 (נמדד עם מד pH והותאם עם NaOH ו- HCl).
- שמור על זרימה קבועה של 3 מ"ל / דקה של תמיסת הקלטה דרך הרקמה באמצעות כוח הכבידה, יחד עם משאבה פריסטלטית בשטף נמוך כדי לחלץ את הנוזל מהתא תוך שמירה על נפח קבוע. כדי להשיג את הזרימה הנדרשת, מקם את הצינורות המכילים תמיסה (צינורות פלסטיק 50 מ"ל) 25 ס"מ מעל שלב המיקרוסקופ.
הערה: זרימה מונעת כבידה זו משמשת למניעת תנועת רקמות הנגרמת על ידי משאבות פריסטלטיות, ומאפשרת ניתוח תמונה מדויק יותר בהמשך. - לפני כל גירוי, שמור על זרימת פתרון ההקלטה במשך 5-10 דקות כדי לקבל בסיס יציב של פלואורסצנטיות מהחיישנים. שנה את משך הזמן לפי הצורך כדי להשיג תוכנית בסיסית זו.
- החלף את התמיסה הזורמת בתמיסת הגירוי למשך 5 דקות כדי לעורר את VNC/FBs (עם גלוקוז, פירובט או לקטט בריכוז המתואר עבור כל ניסוי מומס בתמיסת מלח; ראה כל איור).
הערה: משך הגירוי יכול להשתנות בהתאם לצרכי הניסוי (לדוגמה, ניתן להגדיל את פעימות הגלוקוז ל -10 דקות כדי להגיע לרמה בנוירונים, כפי שדווח בעבר16). - כדי לשמור על אוסמולריות בתמיסת הגירוי, תקן את ריכוז הסוכרוז (פחמימה שאינה ניתנת לחילוף חומרים על ידי מוח הדרוזופילה ) על פי ריכוז המונוקרבוקסילט או הגלוקוז שנוסף.
- שנה את הפתרונות באמצעות מערכת פשוטה של שסתומים. היזהרו לא להזיז את שלב המיקרוסקופ.
- חשוף את VNC 80 מיקרומטר picrotoxin (PTX, זורם ברציפות) כדי לעורר פעילות עצבית. הליך זה מגביר את התדירות של תנודות Ca2+ , ומאפשר לצפות בשינויים במולקולות רלוונטיות מטבולית (למשל, ATP תוך תאי).
- בסוף כל ניסוי, שטפו היטב את מערכת הזרימה המלאה, כולל הצינורות ותא ההקלטה, למשך 10 דקות לפחות עם תמיסת המלח ועוד 10 דקות עם מים מזוקקים כדי לחסל כל זכר לתמיסות בהן נעשה שימוש.
5. עיבוד תמונה וניתוח נתונים
- כדי לעבד את התמונות שהתקבלו, המשיכו בשלבים המוצגים באיור 3.
- ייבא את התמונה (לקונית) לתוכנת ImageJ. לתמונה יש שתי תצוגות של המדגם: השמאלית היא אות mTFP וזו מימין היא אות נוגה. בחר אזור הכולל את התאים לניתוח והפרד תמונות אלה (mTFP ו- Venus) בחלון חדש. ודא שתמונות אלה כוללות בדיוק את אותו אזור.
- פתח את תוסף הרישום ותקן את הסחף הקטן של הרקמה שנצפה בדרך כלל בניסוי עם הגוף הנוקשה של הפונקציה. בצעו זאת בשתי התמונות (mTFP ו-Venus).
- בחר לפחות 10 אזורי עניין (ROIs) בציטוזול של 10 התאים המתאימים באות mTFP (488 ננומטר) והעבר את הבחירות לתמונת ונוס (540 ננומטר).
- בחר שניים או שלושה ROI קרוב לתאים המנותחים אך ללא אות מובחן (תמיד בתוך VNC או רקמה מנותחת, ראה איור 3). אלה הם החזרי ההשקעה ברקע.
- כאשר החזר ההשקעה נבחר בשתי התמונות, קבל את הערך האפור הממוצע של כל אות באמצעות מדד הפונקציה. העבר את הנתונים לגליון נתונים והפחת את ערך הרקע הממוצע עבור כל אות.
- קבע את יחס הפלואורסצנטיות mTFP מעל ונוס (עבור לקוני ופירוני). ערך זה מחושב באופן שונה מחיישני FRET אחרים המתוארים כאן (כאשר היחס הוא בדרך כלל YFP/CFP) מכיוון שכאשר הם קשורים למצעים המתאימים שלהם, הן לקונית והן פירונית מפחיתות את יעילות ה- FRET שלהם.
- נרמול הנתונים המחלקים כל ערך נרשם בקו הבסיס. בגיליון נתונים נפרד, חשב את קו הבסיס על ידי לקיחת הערך הממוצע של יחס mTFP/ונוס במהלך 2 הדקות שקדמו לגירוי.
- עבור מדידות הסוכר וה-ATP באמצעות חיישנים מבוססי FRET, חשב את יחס YFP/CFP ונמל את הנתונים כמתואר בשלב 5.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במשך עד שעה אחת, הליך זה מאפשר מדידה קלה של שינויים תוך תאיים בפלואורסצנטיות של חיישני מונוקרבוקסילט וגלוקוז. כפי שניתן לראות באיור 4, חיישנים לקוניים הן בתאי גלייה והן בתאי עצב מוטוריים מגיבים ללקטט של 1 מילימטר בקצב דומה בתחילת הדופק, אולם תאי עצב מוטוריים מגיעים לעלייה גבוהה יותר מעל קו הבסיס במהלך פעימת 5 דקות, כפי שהודגם קודם לכן17. ריכוז לקטט זה נבחר מכיוון שהוא דומה לרמות הנמצאות בהמולימפה של זחלי כוכב שלישי. באופן דומה, כאשר חיישני גלוקוז המבטאים VNC נחשפו לגלוקוז של 5 מילימטר (ערך דומה לזה שנמדד בהמולימפה על ידינו ועל ידי אחרים19), האות של החיישן גדל בקצב דומה בתאי גלייה ובנוירונים. במהלך דופק הגלוקוז, לעומת זאת, האות בתאי עצב עולה יותר מאשר בתאי גלייה. זה עולה בקנה אחד עם תצפיות קודמות של תכשירים דומים המבטאים חיישני FRET16.
הכנה זו יכולה לשמש לביצוע ניסויים על מונוקרבוקסילט ומובילי גלוקוז לא מתוארים המתבטאים בתאי גליה דרוזופילה או נוירונים20. כאן אנו מדגימים את השימוש בהפרעות רנ"א כדי להראות שצ'אסקי (Chk), שהיה ידוע בעבר כמעביר מונוקרבוקסילטים בתאים הטרולוגיים, מעביר לקטט בתאי גלייה (איור 5). בתנאי הגבלה תזונתיים, טרנספורטר זה תואר כממלא תפקיד חשוב בפיזיולוגיה ובהתנהגות של בעלי חיים21 . מצאנו שבתאי גלייה, הוצאת Chk הפחיתה את העברת הלקטט בהשוואה לקבוצת ביקורת VNCs שנחשפו ללקטט של 1 מילימטר (איור 5). טרנספורטרים פוטנציאליים אחרים יכולים להיבדק כדי לראות אם הם יכולים להעביר מטבוליטים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
כדי לטפל בחקר שינויים מטבוליים הקשורים לפעילות עצבית, פיתחנו שיטה פשוטה להגביר את הפעילות העצבית מבלי להשתמש בפרוצדורות מורכבות מבחינה טכנית כמו אופטוגנטיקה, שיכולות להפריע למדידות חיישני FRET (איור 6). VNC המבודד נחשף לפיקרוטוקסין (PTX), אנטגוניסט קולטן GABAA ידוע ששימש בעבר אותנו ואחרים17,22. הריכוז המשמש מגביר את התדירות של תנודות סידן בנוירונים (כפי שנמדד על ידי שינויים בפלואורסצנטיות GCaMP6f) כמו גם שינויים משמעותיים במולקולות רלוונטיות מטבולית כמו גלוקוז, לקטט ופירובט17. יתר על כן, עליות המושרות על ידי PTX בפעילות העצבית גורמות לירידה חולפת ברמות ATP בסומה של נוירונים מוטוריים. תופעה זו תוארה בעבר במודלים של בעלי חוליות שבהם הפעילות העצבית הוגברה באמצעות גירוי חשמלי או באמצעות אנטגוניסטים לקולטן GABAA 23,24. כתוצאה מכך, מודל זה יכול לשמש למעקב אחר שינויים מטבוליים בתת-קבוצות ספציפיות של נוירונים ותאי גלייה, תוך מתן מענה לצורך בטרנספורטרים הקשורים לאנרגיה התורמים לייצור ATP במהלך פעילות עצבית גבוהה.
הובלת גלוקוז ומונוקרבוקסילט חשובה גם ברקמות או בתאים שאינם המוח. אנו מראים כאן את ההדמיה של מונוקרבוקסילט (לקטט/פירובט) וספיגת גלוקוז בגופי שומן, רקמה רלוונטית מבחינה מטבולית הקיימת בזחלים ובזבוב הבוגר שיש לה מספר פונקציות מפתח כגון אחסון שומנים ומטבוליזציה25. החיישן הלקוני מבוטא היטב ב-FB, כפי שמוצג באיור 7, שבו ניתן לראות את טיפות השומנים ככדורים שחורים זעירים בתוך התא. רקמה מבודדת זו נצמדת היטב לכיסויים המצופים בפולי-L-ליזין, ומאפשרת הליך הדמיה תאי ארוך טווח שקל גם לנתח. ראינו עלייה משמעותית בפלואורסצנטיות של חיישן הגלוקוז כאשר FB נחשף לעלייה בריכוזי הגלוקוז (כ-5 מילימול), שזה קרוב לריכוז הגלוקוז שנמצא בהמולימפה. חשיפה נוספת לריכוזים גבוהים יותר של גלוקוז (10 מילימול) אינה גורמת לעלייה הצפויה בפלואורסצנטיות של החיישן. לבסוף, ב-FB הצלחנו למדוד יבוא לקטט ופירובט (איור 7C,D). במקרה זה, הגדלת ריכוזי הלקטט והפירובט גורמת לעלייה פרופורציונלית בפלואורסצנטיות לקונית ופירונית (הנעה בין 0.1 ל -1 מילימול). ריכוזים גבוהים יותר של מונוקרבוקסילט גורמים לרוויית אותות בתוך התאים.
איור 1: סנכרון של זחלי דרוזופילה . הליך סנכרון הזחל מתואר באופן גרפי. שעתיים לפני תחילת התהליך יש להכין צלחות אגרוז 1% ולהחליף פעמיים ביום עד היום הרביעי. את הזחלים הבוקעים יש לאסוף בזהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מוח זחל דרוזופילה מבודד המבטא את חיישן הלקטט לקוני. (A) תמונה מייצגת של VNC מופרד של זחל דרוזופילה מבודד מכוכב שלישי המודבק לכיסוי מצופה פולי-L-ליזין ומבטא את חיישן הלקטט לקוני בנוירונים מוטוריים (OK6-GAL4). התמונות מציגות תמונת שדה בהיר של VNC (משמאל) ופלואורסצנטיות mTFP (לוח אמצעי) של החיישן שצולמה עם יעד טבילה במים פי 20. התמונות בחלונית התחתונה הן של אותו VNC שצולמו עם מטרה טבילה במים פי 40. (B) נוירונים מוטוריים מ-VNC המבטאים את חיישן הלקטט הלקוני (OK6>לקוני) הממוקם בתמיסת מלח ללא לקטט. התמונה מתארת פלואורסצנטיות mTFP (משמאל), פלואורסצנטיות ונוס (במרכז) והיחס בין שתי הפלואורסצנטיות (מימין, מיוצר באמצעות תוסף רציו פלוס של תוכנת ImageJ). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A, פנל עליון), 10 מיקרומטר (לוח תחתון A , B). קיצורים: VNC = חוט עצב גחוני; mTFP = חלבון פלואורסצנטי מונומרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח שלב אחר שלב של התמונות. איור סכמטי של פרוטוקול תוכנת ImageJ לניתוח תמונה, הצגת התהליך (עמודה ראשונה), פקודות ImageJ (עמודה שנייה) ותוצאות עיבוד תמונה (עמודה שלישית). הדוגמה מתחילה בתמונה גולמית שנלקחה מ-VNC ומבטאת את חיישן הלקטט הלקוני בנוירונים מוטוריים (OK6-GAL4). קיצורים: VNC = חוט עצב גחוני; mTFP = חלבון פלואורסצנטי מונומרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מונוקרבוקסילט והובלת גלוקוז בתאי עצב ובתאי גלייה במוח הזחל של דרוזופילה . (A) תמונות מייצגות של VNC המבטאות את חיישן הלקטט לקוני בנוירונים מוטוריים (OK6-Gal4>Laconic). פלואורסצנטיות לקונית בנוירונים מוטוריים נראית לפני, במהלך ואחרי דופק של 5 דקות של 1 מילימטר לקטט. תוסף Ratio Plus של ImageJ שימש ליצירת תמונות יחס (mTFP/Venus). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) הקלטות מייצגות של אותות FRET מ-VNCs מבודדים המבטאים את חיישן הלקטט הלקוני בנוירונים מוטוריים (OK6-GAL4, קווים אפורים) או בתאי גלייה (REPO-GAL4, קווים שחורים) שנחשפו ללקטט של 1 מילימטר למשך 5 דקות. העקבות מתארות את אותות ה- FRET המותאמים לערך הממוצע שנאסף 2 דקות לפני החשיפה ללקטט. (C) הקלטות מייצגות של אותות FRET מ-VNCs מבודדים המבטאים את חיישן הגלוקוז FLII12Pglu700μδ6 בנוירונים מוטוריים (OK6-GAL4, קווים אפורים) או תאי גלייה (REPO-GAL4, קווים שחורים) שנחשפו לגלוקוז של 5 מילימטר במשך 5 דקות. העקבות מתארות את אותות FRET המותאמים לערך הממוצע שנאסף שתי דקות לפני החשיפה לגלוקוז. קיצורים: VNC = חוט עצב גחוני; mTFP = חלבון פלואורסצנטי מונומרי; FRET = העברת אנרגיית תהודה Föster. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הובלת לקטט בתאי גלייה במוח הזחל דרוזופילה המבטא RNAi של צ'אסקי. (A) VNC מבודד המבטא את חיישן הלקטט לקוני בלבד (בקרה גנטית, w1118, קו שחור) או המבטא במשותף RNAi כדי להפיל ביטוי Chaski (Chk) (chk-RNAi, magenta) נחשפו ללקטט 1 mM במשך 5 דקות. עבור כל תנאי, העקבות מייצגות את ערך ה- FRET הממוצע המתקבל משבעה VNCs נפרדים (70 תאים לכל תנאי, מנורמל באמצעות הערך הממוצע המתקבל 2 דקות לפני החשיפה ללקטט). (B) האזור שמתחת לעקומה ב-A משמש לחישוב הצטברות לקטט תוך-תאית. עבור כל תנאי, הערכים הם SE הממוצע מתוך 70 תאים ושבעה ניסויים עצמאיים (בקרה או chk-RNAi). מבחן t של הסטודנט הלא מזווג שימש לניתוח סטטיסטי (*p < 0.05). קיצורים: VNC = חוט עצב גחוני; FRET = העברת אנרגיית תהודה Föster. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שינויים ברמות ATP עצביים הנגרמים על-ידי חשיפה לפיקרוטוקסין. הקלטות של הפלואורסצנטיות שנלכדו מ-VNCs המבטאים את חיישן הסידן המקודד גנטית (A) GCaMP6f או (B, סדרת ניסויים שונה) חיישן ATP AT1.03NL בנוירונים מוטוריים (OK6-GAL4) שנחשפו לאנטגוניסט קולטן GABAA פיקרוטוקסין (80 מיקרומטר) במהלך הזמן שצוין על ידי הקו. ההקלטה המייצגת מגיעה מתא עצב מוטורי יחיד מ-VNC ( ב-A) או מממוצע ± SE מ-10 תאים מ-VNC יחיד ( ב-B) המנורמל לערכים הממוצעים שהתקבלו 2 דקות לפני החשיפה ל-PTX. קיצורים: VNC = חוט עצב גחוני; PTX = picrotoxin; SE = שגיאת תקן; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הובלה של מונוקרבוקסילט וגלוקוז בגופי שומן דרוזופילה . (A) תמונה של גוף השומן המבודד מזחלי כוכב שלישי המבטאים את חיישן הלקטט לקוני (mTFP fluorescence). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) עקבות מייצגים של האות המנורמל שנלכד ב-FB המבטא את חיישן הגלוקוז (FLII12Pglu700μδ6) שנחשף לגלוקוז (1, 5 ו-10 מילימטר גלוקוז). הנתונים נורמלו לשתי הדקות הראשונות לפני החשיפה לגלוקוז. (ג,ד) עקבות מייצגים של האות המנורמל המתקבל מ- FB המבטא את חיישן הלקטט (C) או את חיישן הפירובט (D) החשופים ל- 0.1-0.5-1 מילימטר של לקטט או פירובט. הנתונים נורמלו לשתי הדקות הראשונות לפני החשיפה ללקטט או פירובט. קיצורים: FB = גוף שמן; mTFP = חלבון פלואורסצנטי מונומרי; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש במודל דרוזופילה לחקר חילוף החומרים במוח הוא חדש יחסית26, והוכח כי הוא חולק מאפיינים רבים יותר עם מטבוליזם של יונקים מהצפוי, אשר נחקר בעיקר במבחנה בתרביות נוירונים ראשוניות או בפרוסות מוח. דרוזופילה מצטיינת בניסויי in vivo הודות לסוללת הכלים הגנטיים והחיישנים המקודדים גנטית הזמינים המאפשרים לחוקרים לדמיין בזמן אמת את השינויים המטבוליים הנגרמים על ידי פעילות מושרית או אפילו בתגובה לגירוי חושי.
הפרוטוקול המתואר כאן מראה כיצד למדוד מונוקרבוקסילט והובלת גלוקוז בתאי גלייה ונוירונים של Drosophila VNC בתכשיר ex-vivo המאפשר שימוש בחיישנים מטבוליים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית המבוססים על מיקרוסקופ FRET כדי ליצור סרטוני קיטועי זמן של שינויים מטבוליים בתאי עצב במנוחה ובנוירונים פעילים. פרוטוקול זה ניתן להרכבה ולביצוע בקלות בכל מעבדה באמצעות מודל דרוזופילה ללא שימוש במכונות מורכבות, באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במערכת פיצול פליטות. ניתן גם להתאים אותו לציוד מתקדם יותר כמו דיסק מסתובב, לייזר קונפוקלי או מיקרוסקופים של שני פוטונים (אך נדרש מפצל כדי לחלק את פליטת האור) כדי להקליט תאים ספציפיים הממוקמים עמוק יותר במוח כפי שקורה במוח דרוזופילה בוגר. מכיוון שסוגים אלה של אותות מטבוליים איטיים יחסית, אין צורך במצלמת וידאו מהירה או יקרה.
בנוסף, הכנת VNC או FB המבודדת אינה זקוקה לשיטה מתוחכמת לתיקון תנועה הנדרשת לעיתים עבור הקלטות in vivo . תוספי ImageJ יכולים לתקן באופן משביע רצון את רוב התנועות של VNCs המיוצרים במהלך הניסוי. כתוצאה מכך, הגברת הפעילות העצבית על ידי הוספת PTX או הוספת מטבוליטים רלוונטיים יכולה להתבצע בו זמנית ללא הבעיות הנגרמות על ידי התכווצות שרירי הגוף הטבעית, כפי שניתן לראות בפרוטוקולים אחרים (כגון הכנת פילה)27.
אנו מראים ניסויים מייצגים שבהם הובלת לקטט וגלוקוז נצפית בבירור בריכוזים רלוונטיים פיזיולוגית של מטבוליטים אלה (1 ו -5 מילימול, בהתאמה). מכאן, צפוי כי כל גן לא מאופיין או חלבון שדווח בעבר יכול להיבדק ליכולת הובלה בתנאים שונים, כגון באמצעות מודלים שונים של מחלות נוירודגנרטיביות או עלבונות מטבוליים (דיאטות עתירות קלוריות או הגבלת חומרים מזינים). בהקשר זה, אנו מראים כי הפלת RNAi בתיווך של טרנספורטר מונוקרבוקסילט ידוע מפחיתה את העברת הלקטט בתאי גלייה באופן משמעותי. באופן מעניין, האותות המתקבלים מחיישנים לקוניים ופירוניים רגישים מאוד לשינויים בלקטט או פירובט במדיה, ומאפשרים מדידה מדויקת של השינויים התוך-תאיים במטבוליטים אלה. נראה כי טווח דינמי רחב זה של האות שונה בתאי יונקים, שם נצפה קשר לא ליניארי בין אות החיישן לבין ריכוז הלקטט התוך-תאי28.
גישה זו יכולה לספק תשובות להיבטים חשובים לגבי היכן ומתי מונוקרבוקסילטים וגלוקוז מעובדים או מנוצלים לייצור אנרגיה במוח במהלך פעילות עצבית בסיסית וגבוהה. העלייה בפעילות העצבית הנגרמת על ידי PTX יכולה לגרום לשינויים ניכרים במטבוליטים הקשורים לאנרגיה, באופן דומה למה שנראה בתרביות תאים, שקופיות מוח ואורגניזמים חיים23,24. באופן ספציפי, זינוק בייצור ATP מתרחש דקות לאחר עלייה בפעילות העצבית, ככל הנראה עקב מטבוליזציה של גלוקוז וחילופי לקטט ופירובט בין תאי גליה ונוירונים, כפי שדווח בעבר17. המחקר של הצרכים של תאים ספציפיים לאספקת גלוקוז ו monocarboxylates, כמו גם את המנגנונים העומדים בבסיס התחבורה שלהם או הייצור, יכול להתאפשר על ידי מניפולציה של ביטוי של גנים מסוימים בשילוב עם השימוש חיישנים מקודדים גנטית.
רקמות אחרות בעלות חשיבות מטבולית יכולות להיקשר בקלות לכיסויים מצופים פולי-L-ליזין ולבצע הדמיה של שינויים מטבוליטים במשך מספר דקות. ניתן לחקור טרנספורטרים חדשניים המתווכים הובלת גלוקוז או לקטט ברקמות שונות. גלוקוז במחזור מועבר כדי לייצר את טרהלוז disaccharide בגופי שומן הזחל באמצעות מנגנונים שאינם מובנים במלואם, שיטות אלה יכולות לעזור להבין טוב יותר את המסלול הזה. יתר על כן, תחת הגבלה תזונתית, חומצות שומן יכולות להיות מטבוליזם כדי לייצר גופי קטון ב- FB והטרנספורטרים הדרושים כדי להוציא אותם להמולימפה עדיין לא ידועים.
חשוב לציין כי פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת הצטברות של מטבוליט לאורך זמן או כדי לקבוע שיעורי עלייה בפלואורסצנטיות של חיישן מסוים בין תנאים, אך לא לשקול באופן רשמי שינויים ב"ריכוז" מכיוון שהדבר ידרוש כיול חיישן באתר. מספר שכבות התא המרכיבות את ה-VNC במקרה זה מגבילות את הדיפוזיה של מולקולות, כגון יונופורים, הנחוצות לכיול זה. עם זאת, אנו ממליצים לעקוב אחר הנחיות עיבוד תמונה המאפשרות ניגודיות רמות לקטט בין איברים או תאים שונים בתוך בעל חיים29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים או כלכליים.
Acknowledgments
אנו מודים לכל חברי מעבדת Sierralta. עבודה זו נתמכה על ידי FONDECYT-Iniciación 11200477 (ל- AGG) ו- FONDECYT Regular 1210586 (ל- JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (חיישן סוכר) נתרם באדיבות על ידי פייר-איב פלסאיס ותומס פראט, CNRS-פריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
