Summary
Rizosferde bitki büyümesini teşvik eden rizobakterilerin (PGPR) kolonizasyonu, büyümeyi teşvik edici etkisi için gereklidir. Bakteriyel rizosfer kolonizasyonunun tespit yöntemini standartlaştırmak gerekir. Burada, kök yüzeyindeki bakteri kolonizasyonunu ölçmek için tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Arabidopsis thaliana kökü üzerinde bakteri kolonizasyonunun ölçülmesi, bitki-mikrop etkileşimi çalışmalarında en sık yapılan deneylerden biridir. Tekrarlanabilirliği artırmak için rizosferdeki bakteri kolonizasyonunu ölçmek için standartlaştırılmış bir yöntem gereklidir. Önce steril A.thaliana'yı hidroponik koşullarda kültürledik ve daha sonra rizosferdeki bakteri hücrelerini 0.01'lik bir OD600 nihai konsantrasyonunda aşıladık. Aşılamadan 2 gün sonra, kök dokusu toplandı ve kolonize olmayan bakteri hücrelerini çıkarmak için steril suda üç kez yıkandı. Kökler daha sonra tartıldı ve kök üzerinde kolonize olan bakteri hücreleri girdap ile toplandı. Hücre süspansiyonu, bir fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ile bir gradyan içinde seyreltildi, ardından bir Luria-Bertani (LB) agar ortamı üzerine kaplandı. Plakalar 37 ° C'de 10 saat inkübe edildi ve daha sonra, LB plakaları üzerindeki tek koloniler sayıldı ve kökler üzerinde kolonize olan bakteri hücrelerini belirtmek için normalize edildi. Bu yöntem, iyi tekrarlanabilirlik ile mono etkileşim koşullarında rizosferdeki bakteri kolonizasyonunu tespit etmek için kullanılır.
Introduction
Tek bir bakteri suşu ile rizosfer kolonizasyonunu tespit etmek için kantitatif ve kalitatif yöntemler vardır. Kalitatif yöntem için, floresansı yapısal olarak ifade eden bir suş kullanılmalı ve floresan dağılımı ve yoğunluğu floresan mikroskobu veya lazer konfokal aletler 1,2 altında incelenmelidir. Bu stratejiler, in situ 3'te bakteri kolonizasyonunu iyi bir şekilde yansıtabilir, ancak miktar belirlemede geleneksel plaka sayma yöntemleri kadar doğru değildir. Ayrıca, mikroskop altında sadece kısmi kök bölgelerinin gösterilmesinin sınırlılığı nedeniyle, bazen subjektif önyargıdan etkilenebilir.
Burada, kolonize bakteri hücrelerinin toplanmasını ve bakteriyel CFU'ların bir plaka üzerinde sayılmasını içeren kantitatif bir yöntemi tarif ediyoruz. Bu yöntem, bitki köklerinden sıyrılan kolonize suşların sayılabildiği seyreltme ve kaplamaya dayanır ve kök üzerindeki toplam kolonize bakteri sayısı 4,5 olarak hesaplanabilir.
İlk olarak, A. thaliana hidroponik koşullarda kültürlendi ve daha sonra bakteri hücreleri rizosferde 0.01 OD600'lük bir nihai konsantrasyonda aşılandı. Enfekte kök dokuları aşılamadan 2 gün sonra toplandı ve kolonize olmayan bakteri hücrelerini uzaklaştırmak için steril suda yıkandı. Ayrıca, kök üzerinde kolonize olan bakteri hücreleri toplandı, fosfat tamponlu salin (PBS) tamponunda seyreltildi ve bir Luria-Bertani (LB) agar ortamı üzerine kaplandı. 37 ° C'de 10 saat inkübasyondan sonra, LB plakaları üzerindeki tek koloniler sayıldı ve köklerde kolonize olan bakteri hücrelerini belirlemek için normalize edildi.
Bu yöntem son derece uygulanabilirdir, iyi tekrarlanabilirliğe sahiptir ve doğru rizosfer bakteri kolonizasyonu tayini için daha uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steril hidroponik A. thaliana yetiştiriciliği
- A. thaliana fidelerini hazırlayın.
- % 2 (ağırlıkça / hacim) sükroz ve% 0.9 (ağırlıkça / hacim) agar ile 1/2 MS ortamdan (Murashige ve Skoog) oluşan kültür A. thaliana fidanları ortamını hazırlayın.
- Hazırlanan sterilizasyon ortamını katılaşmadan önce steril kare Petri kaplarına (13 cm x 13 cm) dökün. Nemi korumak için havayla kurutmaktan kaçının.
- A. thaliana tohumlarını 1 mL steril su ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 4 ° C'de 12 saatten fazla daldırın ve ardından tohumları 1 mL% 2 (hacim / hacim) NaClO ile 2 dakika sterilize edin.
- NaClO çözeltisini çıkarmak için tohumları altı kez steril suyla iyice yıkayın. Tohumları, steril 1 mL uçlu MS agar ortamı ile Petri kaplarına ekin.
- Petri kaplarını nefes alabilen tıbbi bantla kapatın ve 1 hafta boyunca büyümeleri için hafif bir inkübatöre dikey olarak yerleştirin. Işık inkübatörünün gündüz/gece oranını 16 saat/8 saate ayarlayın, sıcaklığı 23 °C'de ve nemi %40-%60'ta tutun.
- Nakil A. thaliana.
- 40 μm gözenek büyüklüğünde hücre boyayıcı üzerine 5 mm'lik delikler açın ve steril hale getirin.
- 7 günlük üç A. thaliana bitkisini bir hücre süzgecinin deliklerinden nakledin ve bunları% 0.5 sükroz içeren 3 mL steril sıvı 1/2 MS ortamı içeren 6 oyuklu bir plakaya koyun.
- 6 oyuklu plakaları hafif bir inkübatöre yerleştirin (Şekil 1A) ve 10 gün boyunca inkübe edin.
2. Bakteri yetiştirme ve aşılama
- Aşılama için bakteri süspansiyonu hazırlayın.
- Bacillus velezensis için, bakteri hücrelerini steril LB ortamına aşılayın ve 37 ° C'de, 0.8-1.2 OD600'e ulaşana kadar 170 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
- Bakteri hücrelerini 2 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri PBS tamponunda (2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2.6 mM KCl) yeniden süspanse edin. LB ortamını ve bakteriyel metabolitleri çıkarmak için santrifüjleme ve yeniden süspanse etme adımlarını 3 kez tekrarlayın.
- Bakteri hücrelerini, OD600 0.01'in nihai konsantrasyonunda taze 1/2 MS ortamında askıya alın. Bakteri süspansiyonlarını A. thaliana fidelerini yetiştiren 6 oyuklu plakalara aşılayın, 6 oyuklu plakaları ışık inkübatöre yerleştirin ve 2 gün boyunca yetiştirin.
3. Köklerde kolonize olan bakterilerin ölçülmesi
- Kök dokusunu toplayın ve kolonize hücreleri plakalayın.
NOT: Tüm adımlar gnotobiyotik koşullar altında yapılmalıdır- 2 mL'lik tüpleri tartın ve ağırlığı W0 olarak kaydedin.
- Birlikte kültürlenmiş A. thaliana kök dokularını hasat edin ve 3 kez steril suda yıkayın. Fazla suyu çıkarmak için kökü filtre kağıdına yerleştirin.
- Kökü tartılmış mikrosantrifüj tüpüne koyun, kökleri tüp ile birlikte tartın ve W1 olarak kaydedin.
- Her tüpe 1 mL PBS ekleyin ve tüpleri maksimum hızda 8 dakika boyunca girdaplayın.
- Süspansiyonları toplanan kök kolonize bakteri hücreleri ile 1 x 10-1-1 x 10-4'e seyreltin (bakteri kolonizasyon kabiliyetine göre). Seyreltilmiş bakteri süspansiyonlarını LB agar ortamı içeren plakalara yayın ve 37 ° C'de 10 saat inkübe edin.
- Kolonileri sayın ve verileri normalleştirin.
- LB plakalarındaki bakteri kolonilerini sayın.
- CFU'ları karşılık gelen seyreltmeye göre hesaplayın ve verileri kök taze ağırlığı (W1-W 0) ile normalleştirin. Nihai sonuçlar, aşılamadan 2 gün sonra bir gram kök başına kolonize edilen bakteri hücrelerinin sayısını göstermektedir (Şekil 1B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A. thaliana rizosferinde bu yöntemle tespit edilen bakteri kolonizasyon yeteneğinin doğruluğunu test etmek için, Bacillus velezensis SQR9 WT ve türetilmiş bir mutant Δ8mcp'yi A. thaliana rhizosphere'e ayrı ayrı aşıladık. Δ8mcp, tüm kemoreseptör kodlayan genlerden yoksun bir mutanttır ve önemli ölçüde azalmış bir kolonizasyonasahiptir 6. Kolonizasyonlarını mevcut kök kolonizasyon testi ile aşılamadan 2 gün sonra ölçtük. Sonuçlar, Δ8mcp'de önemli bir kök kolonizasyonu azalması gösterdi, bu da bu durumun ve yöntemin bakteri kolonizasyonunu etkili bir şekilde ölçtüğünü gösteriyor (Şekil 1C).
Şekil 1: Büyüyen A. thaliana ve Bacillus velezensis SQR9 ve Δ8mcp'nin kök kolonizasyonu. (A) 7 günlük A. thaliana'nın hidroponik durumda hücre boyayıcı ile 6 oyuklu plakalarda büyümesinin üstten görünümü. (B) Her biri 3 fide içeren 6 oyuklu plakalarda büyüyen 7 günlük A. thaliana'nın yandan görünümü. (C) B. velezensis vahşi tip SQR9 ve Δ8mcp'nin kolonizasyonu, sunulan test kullanılarak ölçülmüştür. Altı kopya dahil edildi ve veriler ortalama ± SEM olarak sunuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İyi bir tekrarlanabilirlik elde etmek için, bu protokolün kolonizasyon tespit süreci için dört kritik adım vardır. İlk olarak, aşılanan bakteri hücrelerinin sayısının her deneyde tam olarak aynı olduğundan emin olmak gerekir. İkincisi, kolonize olmayan bakteri temizleme yoğunluğunu steril su ile kontrol etmek de gereklidir. Üçüncüsü, mikrosantrifüj tüpüne batması kolay olan bakterilerin özelliklerinden dolayı absorpsiyon hatalarını önlemek için numunenin tam bir karıştırma durumunda olmasını sağlamak için her numune seyreltme işleminin gerçekleştirilmeden önce girdaplanması gerekir. Bu nedenle, her emilimden önce bakteri süspansiyonunu karıştırmak için bir girdap aleti kullanmanızı öneririz. Dördüncüsü, herhangi bir kontaminasyon olasılığını önlemek için bu yöntemi kullanan tüm operasyonlar sırasında asepsi kesinlikle sağlanmalıdır.
Bu yöntem, kök yüzeyinde kolonize olan bakterileri belirlemek için kullanılır. Kök yüzeyi bakterileri dışında, endofitik bakteriler ve mantarlar da bitki rizosferini kolonize eder7. Endofitik bakterilerin kolonizasyon yeteneği, bu yazıda açıklanan protokol kullanılarak hala tespit edilebilir, ancak kök dokusu endofitik bakterileri serbest bırakmak için öğütülmelidir. Bununla birlikte, endofitik mantarlar bakterilerden farklıdır. Ana akım yöntemlerin çoğu, görselleştirme8 için floresan etiketleme bakterilerine benzer kalitatif bir tespit yöntemi olan hiflerin büyümesini gözlemlemek için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanır.
Farklı suşların kolonizasyonunu karşılaştırırken, bakteriyel uçucu bileşiklerin9 ve bitki uçucu bileşiklerinin10,11 etkisinden kaçınmak için 6 oyuklu bir plakaya aşılanmamalıdırlar. SQR9'un kolonizasyonu 2 ila 4 gün arasında maksimuma ulaştığı için kökü tespit etmek için aşılamadan 2 gün sonra seçtik; Bakteri kolonizasyonunu tespit etme süresi suşlara göre ayarlanabilir.
Açıklanan diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem doğru ve kullanımı kolaydır. Örneğin, Noam ve ark. hidroponik durumanakledildiğinde hemen bakterilerle aşılanmış katı büyümüş arabidopsis 12,13. Burada, bitki adaptasyonunun değişen büyüme ortamına etkisinden kaçınmak için bakterilerin nakilden birkaç gün sonra rizosfere aşılanmasını öneriyoruz. Bu çalışmada açıklanan yöntem, bitkilerin kolonizasyonu etkileyen kök eksüdasını serbest bırakması için de iyidir.
Bitki sürgünlerinin havada ayrı ayrı büyümesine ve sıvıya daldırılmasından tamamen uzaklaşmasına izin vermek için, bu hidroponik yöntem için kullanılabilir hale getirmek için hücre boyayıcı üzerinde bazı küçük değişiklikler ve işlemler yaptık. Ayrıca, bu yöntem, küçük miktarlarda doğru bakteri kolonizasyonu tayini için daha uygundur, ancak hidrokültürde toplanan büyük miktarlarda kök eksüdaları için uygun değildir14. Bu yöntemin daha önce yayınlanmış çalışmalara göre değiştirildiğine dikkat etmek önemlidir 12,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32370135), Çin Tarım Bilimleri Akademisi İnovasyon Programı (CAAS-CSAL-202302), Jiangsu Tarım ve Ormancılık Meslek Yüksekokulu Bilim ve Teknoloji Projesi (2021kj29) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M.
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -E., Won, M. -H., Jeong, M. -I., Oh, K. -K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
