Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Summary

Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Zebrafisch Retina mit und ohne Pigmentepithel angebracht, von einem bis drei Tagen der Befruchtung Embryonen microdissect.

Abstract

Zebrafisch ist ein beliebter Tiermodell zur Erforschung der Entwicklung des Auges wegen seiner schnellen<em> Ex utero</em> Entwicklung und gute Fruchtbarkeit. Von 3 Tagen nach der Befruchtung (DPF), werden die Larven zeigen die erste visuelle Antwort. Viele Gene sind identifiziert worden, um eine ordnungsgemäße Entwicklung des Auges steuern, aber wir sind weit von einem vollständigen Verständnis der zugrunde liegenden genetischen Architektur. Whole Genome Genexpressions-Profiling ist ein nützliches Werkzeug, um Genregulationsnetzwerk für Entwicklung des Auges zu erläutern. Allerdings macht die geringe Größe des embryonalen Auges in Zebrafisch es schwierig, intakt und rein Augengewebe für die Expression Analyse zu erhalten. Zum Beispiel ist die anterior-posterior Länge des Auges zwischen Tag 2 und 3 nur etwa 200-300 um, während der Durchmesser der Linse ist weniger 100 um. Außerdem ist das retinale Pigmentepithel (RPE) der Netzhaut zugrunde liegende nur ein Single-Layer-Epithel. Während Genexpressionsprofile aus der ganzen Embryos gewonnen werden können, tun sie nicht genau die Expression dieser Gewebe. Deshalb reine Gewebe muss für eine erfolgreiche Genexpressionsanalysen von der Entwicklung des Auges erreicht werden. Um dieses Problem anzugehen, haben wir einen Ansatz zur intakten Netzhaut und der Netzhaut mit RPE 1 bis 3 dpf angebracht, die wichtigsten Stadien der Morphogenese Auge abdecken microdissect entwickelt. Alle Vorgänge können mit feinen Pinzetten und allgemeinen Laborbedarf unter Standard-Stereomikroskope durchgeführt werden. Für Netzhaut Dissektion ist die Single-Layer-RPE entfernt und durch Bürsten Aktion und die bevorzugte Einhaltung der RPE Reste auf der Oberfläche der Kulturplatte für die Präparation geschält. Für RPE-attached Netzhaut Dissektion, ist die Einhaltung von RPE der Dissektion Platte vor der Dissektion entfernt, so dass der RPE vollständig mit der Retina erhalten. Eine sorgfältige Hubwirkung dieses Gewebes können effizient trennen die mutmaßlichen Ader-und Lederhaut. Die Linse kann in beiden Fällen durch eine chemisch geätzt Wolframnadel entfernt werden. Kurz gesagt, unser Ansatz erhalten intakte Auge Gewebe und wurde erfolgreich genutzt, um Gewebe-spezifische Expression Profile der Zebrafisch-Retina-Studie^{1, 2} Und Pigmentepithel³.

Protocol

Teil 1: Vorbereitungen vor Mikrodissektion Lösungen E3 Medium 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 und 0,33 mM MgSO 4). Ringer-Lösung 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2), sterilfiltriert. 5N NaOH. Chemisches Ätzen von Wolfram Nadeln Sichern Sie sich einen kleinen Becher mit 5N NaOH auf einer Petrischale mit Ton. Bringen S…

Discussion

Mikrodissektion von Zebrafisch Augengewebe effektiv erhalten intakte Netzhaut und RPE-attached Netzhaut. Diese im Wesentlichen unterstützt Ausdruck Studien in Bezug auf ein bestimmtes Augengewebes (dh Netzhaut oder RPE). In der Tat haben wir erfolgreich diese Verfahren genutzt werden, um RNA Expressionsprofile der ganze Netzhaut ¹ und RPE ^{3 zu} erhalten. Der Nutzen dieser Profile ist stark von unserer letzten Identifizierung von Wegen und Gen-Familien, die in einem Retina-Differenzierung mutierten …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Cordless pestle motor		VWR	47747-370
DC power supply		Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)		VWR	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox		World Precision Instruments	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox		Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm		BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope		Olympus	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone		Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate		Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL		Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter		World Precision Instruments	TGW1510
Wooden Applicator		Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.