Microdissection av Zebrafish Embryonala Eye vävnader
Summary
I artikeln beskrivs en metod för microdissect zebrafisk näthinnor med och utan pigmentepitelet bifogade, från en till tre dagar postfertilization embryon.
Abstract
Zebrafisk är en populär djurmodell för forskning om ögats utveckling på grund av dess snabba<em> Ex utero</em> Utveckling och god fruktsamhet. Genom tre dagar efter befruktningen (DPF), kommer larverna visa de första visuella svar. Många gener har identifierats för att styra en riktig öga utveckling, men vi är långt ifrån en fullständig förståelse av de bakomliggande genetiska arkitekturen. Hela genomet genuttryck profilering är ett användbart verktyg för att belysa genetiska reglerande nätverk för ögat utveckling. Men gör den lilla storleken på embryonala ögat i zebrafisk det svårt att få intakt och ren blick vävnader för uttryck analys. Till exempel är den främre-bakre längd ögat mellan dag 2 och 3 endast ca 200-300 ìm, medan diametern på objektivet är minus 100 ìm. Dessutom är pigmentepitelet (RPE) som ligger bakom näthinnan bara ett lager epitel. Medan genuttryck profiler kan erhållas från hela embryot de inte korrekt representerar ett uttryck för dessa vävnader. Därför ren vävnad måste inhämtas för en lyckad profilering av genuttryck för ögonens utveckling. För att lösa detta har vi utvecklat ett förhållningssätt till microdissect intakt näthinnan och näthinnan med RPE bifogade 1-3 DPF, som täcker viktigaste stegen i ögats morfogenes. Alla förfaranden som kan göras med fin pincett och allmänna förnödenheter laboratorier under standardiserade stereomikroskop. För näthinnan dissektion är enkla lager RPE bort och skalas av genom att borsta åtgärder och förmånliga anslutning av RPE resterna till ytan av den kultur plåt för dissekering. För RPE-anslutna näthinnan dissektion, är anslutning av RPE till dissekering plattan bort innan dissektionen så att RPE helt kan bevaras med näthinnan. En noggrann lyftet av denna vävnad kan effektivt separera presumtiva åderhinnan och sklera. Linsen kan tas bort i båda fallen med ett kemiskt etsat volfram nål. I korthet kan vår inställning få intakt öga vävnader och har framgångsrikt använts för att studera vävnadsspecifika uttryck profiler av zebrafisk näthinnan<sup> 1, 2</sup> Och pigmentepitelet<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
Microdissection av zebrafisk ögats vävnader effektivt kan få intakt näthinnor och RPE-anslutna näthinnor. Detta hjälper väsentligt uttryck studier som rör en viss ögat vävnad (dvs näthinnan eller RPE). I själva verket har vi använt framgångsrikt dessa förfaranden för att erhålla RNA-uttryck profiler av hela näthinnan 1 och RPE 3. Nyttan av dessa profiler får starkt stöd av våra senaste identifiering av vägar och familjer gen som är störs i en näthinnan differentiering mutan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en start fond från institutionen för biologiska vetenskaper vid Purdue University.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cordless pestle motor | VWR | 47747-370 | ||
| DC power supply | Lascar | PSU130 | Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization. | |
| Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free) | VWR | 47747-366 | These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis. | |
| Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox | World Precision Instruments | 500341 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox | Fine Science Tools | 11252-00 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm | BD Biosciences | 351007 | These plates are used as dissection plates. | |
| Olympus SZX16 Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed. | |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary | |
| Thermo plate | Tokai Hit | MATS-U55SZX2B | This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success. | |
| Trizol, 100 mL | Invitrogen | 15596-026 | ||
| tungsten wire, 0.015 inch diameter | World Precision Instruments | TGW1510 | ||
| Wooden Applicator | Puritan | 807 | This is used for holding the chemically-etched tungsten needle. |
References
- Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
- Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).
- Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish : a practical approach. , (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).
