Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection
Summary
이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Zebrafish는 때문에 급속한의 눈 개발에 연구에 인기있는 동물 모델입니다<em> 예 utero</em> 개발과 좋은 생산력. 3 일간 게시물 수정 (DPF)으로, 애벌레는 첫 번째 시각 응답을 표시합니다. 많은 유전자가 적절한 눈 개발을 제어 식별하지만, 우리는 근본적인 유전자 아키텍처의 완전한 이해를 멀리 아르되었습니다. 전체 게놈의 유전자 발현 프로 파일링은 눈 개발을위한 유전자 규제 네트워크를 명료하게하다하는 유용한 도구입니다. 그러나, zebrafish의 배아 눈의 작은 크기는 어려운 표현 분석을위한 온전하고 순수한 눈 조직을 얻을 수 있습니다. 렌즈의 직경이 적은 100 μm의 동안 예를 들어, 2 일 및 3의 눈 앞쪽에 – 후부 길이에만 약 200-300 μm의 수 있습니다. 또한, 망막을 기본 망막 안료 상피 (RPE)는 단지 하나의 레이어 상피이다. 유전자 발현 프로필은 전체 배아에서 얻을 수 있지만, 그들은 정확하게 이러한 조직의 표현을 대변하지 않습니다. 따라서 조직은 순수한 눈 개발의 성공적인 유전자 발현 프로 파일링에 대한 취득해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 눈을 morphogenesis의 주요 단계를 커버 1-3 DPF의 부착 RPE와 함께 그대로 망막과 망막을 microdissect하는 접근 방식을 개발했습니다. 모든 절차는 표준 stereomicroscopes 이하 벌금 포셉 및 일반 실험실 공급을 할 수 있습니다. 망막 절개 들어, 단일 레이어 RPE 제거하고 작업 및 해부를위한 문화 판의 표면에 RPE 잔존물의 특혜 준수 닦고으로 해제 벗겨. RPE 완전히 망막과 보존 수 있도록 RPE 연결된 망막 절개 들어, 해부 접시에 RPE의 준수는 해부하기 전에 제거됩니다. 이 조직의주의 리프팅 작업은 효율적으로 추정 맥락막과 공막엔을 분리할 수 있습니다. 렌즈는 화학적으로 에칭 텅스텐 바늘로 두 경우 모두에서 제거할 수 있습니다. 즉, 우리의 접근 방식은 그대로 눈 조직을 얻을 수 있으며, 성공적으로 zebrafish 망막의 조직 구체적인 표현 프로필을 연구 활용되었습니다<sup> 1, 2</sup> 및 망막 색소 상피<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
zebrafish 아이 조직의 Microdissection 효과적으로 그대로 망막 및 RPE 연결된 망막을 얻을 수 있습니다. 이것은 실질적으로 특정 안구 조직 (예 : 망막 또는 RPE)에 관한 표현 연구를 지원합니다. 사실, 우리는 성공적으로 전체 망막 1 RPE 3 RNA 발현 프로파일을 얻기 위해이 절차를 이용합니다. 해당 프로필의 유틸리티는 강력 망막 차별 돌연변이에 불안정하게된다 는걸 알수 경로와 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 퍼듀 대학에서 생물학의학과에서 시작 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cordless pestle motor | VWR | 47747-370 | ||
| DC power supply | Lascar | PSU130 | Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization. | |
| Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free) | VWR | 47747-366 | These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis. | |
| Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox | World Precision Instruments | 500341 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox | Fine Science Tools | 11252-00 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm | BD Biosciences | 351007 | These plates are used as dissection plates. | |
| Olympus SZX16 Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed. | |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary | |
| Thermo plate | Tokai Hit | MATS-U55SZX2B | This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success. | |
| Trizol, 100 mL | Invitrogen | 15596-026 | ||
| tungsten wire, 0.015 inch diameter | World Precision Instruments | TGW1510 | ||
| Wooden Applicator | Puritan | 807 | This is used for holding the chemically-etched tungsten needle. |
References
- Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
- Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).
- Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish : a practical approach. , (2002).
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