Kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover
Summary
Kvantifiering av DNA dubbel-strängbrott på grundval av γH2AX foci har blivit ett ovärderligt verktyg, särskilt i strålningsbiologi, för utvärdering av vävnaden strålkänslighet och effekter av strålning ändra föreningar. Här har vi demonstrera användningen av ett immunofluorescens test för kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover.
Abstract
DNA dubbel-strängbrott (DSBs) är särskilt dödlig och genotoxiska skador, som kan uppstå antingen genom endogena (fysiologiska eller patologiska) processer eller av yttre faktorer, framför allt joniserande strålning och radiomimetiska föreningar. Fosforylering av H2A histon varianten, H2AX på serin-139 rester, i starkt konservativa C-terminal SQEY motiv, bildar γH2AX, är ett tidigt svar på DNA dubbel-strängbrott<sup> 1</sup>. Denna fosforylering händelse förmedlas av fosfatidyl-inosito 3-kinas (PI3K) familj av proteiner, ataxi telangiectasia muterad (ATM), DNA-protein kinas katalytiska subenheten och ATM och RAD3-relaterade (ATR)<sup> 2</sup>. Sammantaget, vilket DSB induktion leder till bildandet av diskreta kärnkraft γH2AX härdar lätt kan upptäckas och kvantifieras genom immunofluorescens mikroskopi<sup> 2</sup>. Med tanke på den unika specificitet och känslighet för denna markör, analys av γH2AX foci har lett till ett brett spektrum av tillämpningar inom biomedicinsk forskning, särskilt i strålningsbiologi och nuklearmedicin. Kvantifiering av γH2AX foci har mest studerats i cellsystem kultur i samband med joniserande strålning-inducerad DSBs. Bortsett från cellulära strålkänslighet har immunofluorescens baserade analyser också använts för att utvärdera effekten av strålning ändra föreningar. Dessutom har γH2AX använts som en molekylär markör för att undersöka effekten av olika DSB-inducerande ämnen och är nyligen att inledas som viktig markör för åldrande och sjukdom, särskilt cancer<sup> 3</sup>. Vidare immunofluorescens-baserade metoder har anpassats för att passa upptäckt och kvantifiering av γH2AX foci<em> Ex vivo</em> Och<em> In vivo</em<sup> 4,5</sup>. Här visar vi en typisk immunofluorescens metod för detektion och kvantifiering av γH2AX foci i mus vävnader.
Protocol
Discussion
För denna demonstration använde vi vävnad musen lungor från obehandlade BALB / möss C och från en musmodell för kronisk allergisk luftvägssjukdom. Vi kvantifieras skillnader i antalet foci per cell med något högre medelvärden som observerats i den skadade lungan jämfört med obehandlade avsnitt. Specifikt anges kvantifiering 6,5 foci per / cell och 9,4 fokus per / cell (manuell räkning av 20 celler per avsnitt), i den obehandlade vävnaden och kronisk allergisk luftvägssjukdom vävnad, respektive. Däremot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stödet från Australian Institute of Nuclear Science and Engineering är erkänd. TCK var mottagare av AINSE utmärkelser. Epigenomiska Medicin Lab stöds av det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (566.559). LM stöds av Melbourne Research (University of Melbourne) och biomedicinsk avbildning CRC stipendier kompletterande. Stödet från Monash Micro Imaging (DRS Stephen Cody och ISKA Carmichael) var ovärderlig för detta arbete. MMT är tacksam för sakkunnig hjälp och råd från Dr Olga Sedelnikova från National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
