Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben
Summary
Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrangbrüche auf der Grundlage γH2AX Brennpunkten hat sich zu einem wertvollen Werkzeug, vor allem in der Strahlenbiologie, für die Auswertung von Gewebe Strahlenempfindlichkeit und die Auswirkungen der Strahlung modifizierende Verbindungen. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in Gewebeproben.
Abstract
DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind besonders tödlich und gentoxische Läsionen, die entweder entstehen können durch endogene (physiologischen oder pathologischen) Prozesse oder durch exogene Faktoren, insbesondere ionisierender Strahlung und Radiomimetikums Verbindungen. Die Phosphorylierung der H2A Histon-Variante H2AX, bei der Serin-139-Rest, in der hoch konservierten C-terminalen SQEY Motiv bilden γH2AX, ist eine frühe Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche<sup> 1</sup>. Diese Phosphorylierung Veranstaltung wird von der Phosphatidyl-inosito-3-Kinase (PI3K)-Familie von Proteinen, Ataxie Teleangiektasien mutiert (ATM), DNA-Protein-Kinase-katalytischen Untereinheit und ATM und Rad3 Zusammenhang vermittelt (ATR)<sup> 2</sup>. Insgesamt DSB Induktion führt zur Bildung von diskreten nuklearen γH2AX Herde, die können leicht erkannt und quantifiziert durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie<sup> 2</sup>. Angesichts der einzigartigen Spezifität und Sensitivität dieses Markers, die Analyse der γH2AX Brennpunkte hat zu einer breiten Palette von Anwendungen in der biomedizinischen Forschung geführt, besonders in der Strahlenbiologie und Nuklearmedizin. Die Quantifizierung von γH2AX Foci wurde am häufigsten in der Zellkultur-Systeme im Rahmen der ionisierenden Strahlung induzierte DSBs untersucht. Abgesehen von zellulären Strahlenempfindlichkeit haben Immunfluoreszenz basierte Assays auch verwendet worden, um die Wirksamkeit von Strahlen-modifizierende Verbindungen zu bewerten. Darüber hinaus hat γH2AX als molekulare Marker eingesetzt, um die Wirksamkeit verschiedener DSB-induzierenden Verbindungen zu untersuchen und ist vor kurzem als wichtiger Marker des Alterns und der Krankheit angekündigt, insbesondere Krebs<sup> 3</sup>. Weitere, Immunfluoreszenz-basierten Methoden müssen angepasst Erkennung und Quantifizierung von γH2AX Schwerpunkte angepasst<em> Ex vivo</em> Und<em> In vivo</em<sup> 4,5</sup>. Hier zeigen wir ein typisches Immunfluoreszenz Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von γH2AX Herde im Maus-Gewebe.
Protocol
Discussion
Für den Zweck dieser Demonstration haben wir genutzt Maus Lungengewebe aus unbehandelten Balb / c Mäusen und von einem Mausmodell einer chronischen, allergischen Atemwegserkrankungen. Wir quantifiziert Unterschiede in der Zahl der Herde pro Zelle mit leicht höheren Durchschnitt in der geschädigten Lunge im Vergleich zu unbehandelten Abschnitten beobachtet. Insbesondere angegeben Quantifizierung 6,5 Foci pro / Zelle und 9,4 Foci pro / Zelle (manuelle Zählung von 20 Zellen pro Abschnitt), in der unbehandelten Gewebe …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. LM wird von Melbourne Research (University of Melbourne) und Biomedical Imaging CRC zusätzliche Stipendien unterstützt. Die Unterstützung der Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody und Iska Carmichael) war von unschätzbarem Wert für diese Arbeit. MMT ist dankbar für die Unterstützung von Experten und Beratung von Dr. Olga Sedelnikova von den National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
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