Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters
Summary
Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.
Abstract
DNA dubbel-breuken (DSB's) zijn bijzonder dodelijk en genotoxische letsels, die kan ontstaan door endogene (fysiologische of pathologische) processen of door exogene factoren, met name ioniserende straling en radiomimetische verbindingen. Fosforylatie van de H2A histon-variant, H2AX, op de serine-139 residu, in de zeer geconserveerd C-terminale SQEY motief, de vorming van γH2AX, is een vroege reactie op DNA-dubbel-breuken<sup> 1</sup>. Deze fosforylatie evenement wordt gemedieerd door het fosfatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) familie van eiwitten, ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM), DNA-eiwit kinase katalytische subeenheid en ATM en RAD3-gerelateerde (ATR)<sup> 2</sup>. Over het geheel genomen DSB inductie resulteert in de vorming van discrete nucleaire γH2AX foci die kan gemakkelijk worden opgespoord en gekwantificeerd door immunofluorescentie microscopie<sup> 2</sup>. Gezien de unieke specificiteit en gevoeligheid van deze marker, een analyse van γH2AX foci heeft geleid tot een breed scala aan toepassingen in het biomedisch onderzoek, met name in de straling biologie en nucleaire geneeskunde. De kwantificatie van γH2AX foci is meest onderzocht in celkweek systemen in het kader van ioniserende straling-geïnduceerde DSB's. Naast de cellulaire radiosensitiviteit, hebben immunofluorescentie gebaseerde testen ook gebruikt om de werkzaamheid van de straling-modificerende verbindingen te evalueren. Daarnaast heeft γH2AX is gebruikt als een moleculaire marker om de effectiviteit van verschillende DSB-inducerende verbindingen te onderzoeken en is recent aangekondigd als belangrijke marker van veroudering en ziekte, met name kanker<sup> 3</sup>. Verder, immunofluorescentie-gebaseerde methoden zijn aangepast aan te passen detectie en kwantificering van γH2AX foci<em> Ex vivo</em> En<em> In vivo</em<sup> 4,5</sup>. Hier tonen we een typische immunofluorescentie methode voor de detectie en kwantificering van γH2AX foci in muis weefsels.
Protocol
Discussion
Voor de toepassing van deze demonstratie we muis longweefsel gebruikt van onbehandelde Balb / c muizen en van een muismodel van chronische allergische luchtwegaandoeningen. We gekwantificeerd verschillen in het aantal foci per cel met een iets hogere gemiddelden waargenomen in de beschadigde longen in vergelijking met onbehandelde delen. In het bijzonder, kwantificatie aangegeven 6,5 foci per / cel en 9,4 foci per / cel (handmatige telling van 20 cellen per sectie), in het onbehandelde weefsel en chronische allergische …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De steun van het Australian Institute of Nuclear Science and Engineering wordt erkend. TCK was de ontvanger van AINSE awards. Epigenomisch Medicine Lab wordt ondersteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (566.559). LM wordt ondersteund door Melbourne Research (Universiteit van Melbourne) en Biomedical Imaging CRC aanvullende beurzen. De ondersteuning van Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody en Iska Carmichael) was van onschatbare waarde voor dit werk. MMT is dankbaar voor de deskundige hulp en advies van dr. Olga Sedelnikova van de National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
