Single Cell Transfectie in kippenembryo's
Summary
Met behulp van fijne punt micropipetten we plasmide DNA injecteren in deelgebieden van de kip somieten of neurale buizen. De concentratie van het plasmide is aangepast aan enkele getransfecteerde cellen te genereren. Vervolgens hebben we laten de cellen zich ontwikkelen tot klonale populaties.
Abstract
Een centraal thema in de ontwikkelingsbiologie is de diversificatie van de geslachten en de opheldering van de onderliggende moleculaire mechanismen. Dit houdt een grondige analyse van het lot van afzonderlijke cellen in normale en experimentele omstandigheden. Te dien einde, transfectie methoden die enkele voorlopers doel zijn een eerste vereiste. We beschrijven hier een technisch eenvoudige methode voor het transfecteren enkele cellen in kip weefsels in-ovo, waardoor betrouwbare afstamming tracing en genetische manipulatie. Specifiek weefsel domeinen zijn gericht binnen de somiet of neurale buis, en DNA wordt rechtstreeks geïnjecteerd in het epitheel van belang, wat resulteert in sporadische transfectie van individuele cellen. Met behulp van verslaggevers, kan klonale populaties dus te herleiden tot drie dagen, en het gedrag van genetisch gemanipuleerde klonale populaties kunnen worden vergeleken met die van controles. Deze methode maakt gebruik van de toegankelijkheid van het kippenembryo samen met de nieuwe tools voor genetische manipulatie. We vergelijken en bespreken de voordelen ten opzichte van de veel gebruikte methode elektroporatie, en de mogelijke toepassingen en gebruik in de extra in-vivo modellen zijn ook gesuggereerd. Wij pleiten voor het gebruik van deze methode als een belangrijke aanvulling en een aanvulling voor de bestaande lineage tracing en genetische storing tools.
Protocol
Discussion
De hierboven beschreven methode is een wijziging van een eerder beschreven techniek voor het leveren van lipofiele kleurstoffen aan kleine cel subsets of enkele voorouders 3. Het heeft drie belangrijke voordelen ten opzichte van de standaard electroporatie techniek. Ten eerste biedt het een middel voor het labelen met vertrouwen discrete sites in doelweefsels, wat een grotere ruimtelijke resolutie dan elektroporatie (zie bijvoorbeeld Figuur 1B, C). Ten tweede, het maakt het mogelijk de etikettering van enkele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Shlomi Krispin voor de neurale buis beeld. In het bijzonder, erkennen wij Yuval Kaneel voor het inleiden van de GFP transfectie techniek. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation, Association Française contre les Myopathie, en Deutche Forschungsgemeinshaft, Collaborative Research Centre 488 naar CK
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. . Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
