תא יחיד transfection בעוברים צ'יק
Summary
באמצעות קצה בסדר micropipettes אנו מזריקים פלסמיד דנ"א לתוך תחומי משנה של somites עוף או צינורות עצביים. ריכוז של פלסמיד מותאם לייצר תאים transfected יחיד. לאחר מכן, אנו מאפשרים לתאים להתפתח אוכלוסיות משובט.
Abstract
נושא מרכזי בביולוגיה התפתחותית היא גיוון של שושלות ועל הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס. זה כרוך ניתוח מעמיק של גורלם של תאים בודדים בתנאים נורמליים וניסיוני. לשם כך, שיטות transfection כי היעד אבות חד הם תנאי מוקדם. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה מבחינה טכנית עבור transfecting תאים בודדים ברקמות עוף, אובו, המאפשר מעקב אחר השושלת אמין כמו גם מניפולציה גנטית. תחומים ספציפיים ברקמות ממוקדות בתוך somite או בצינור העצבי, ו-DNA מוזרק ישירות לתוך האפיתל של עניין, וכתוצאה מכך transfection סדירה של תאים בודדים. באמצעות כתבים, אוכלוסיות המשובטים וכתוצאה מכך עלול לייחס לתקופה של עד שלושה ימים, התנהגות של אוכלוסיות המשובטים מניפולציות גנטיות ניתן להשוות עם זה של הביקורת. שיטה זו מנצלת את הנגישות של העובר חומוס יחד עם כלים חדשים עבור מניפולציה גנטית. אנו משווים ולדון יתרונות על פני שיטת בשימוש נרחב electroporation, יישומים אפשריים לשימוש ב-vivo מודלים נוספים הציעו גם הם. אנחנו תומכים את השימוש בשיטה זו כתוספת משלימים משמעותי על השושלת התחקות קיימים כלי התערבות גנטית.
Protocol
Discussion
השיטה המתוארת לעיל הוא שינוי של טכניקה שתואר לעיל עבור אספקת צבעים lipophilic אל תת תאים קטנים או אבות חד 3. יש שלושה יתרונות עיקריים על הטכניקה electroporation סטנדרטי. ראשית, הוא מספק אמצעי עם תיוג אתרים ביטחון דיסקרטית ברקמות היעד, ומאפשר ברזולוציה מרחבית הרבה יותר מאשר el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים שלומי קריספין עבור התמונה בצינור העצבי. בפרט, אנו מכירים יובל קינמון ליזום את הטכניקה transfection GFP. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע, אגודת Francaise contre les Myopathies ו Forschungsgemeinshaft Deutche, מרכז מחקר משותף ל 488 CK
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. . Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
