Одноместный Трансфекция сотовый на куриных эмбрионах
Summary
Использование тонких кончика микропипетки мы вводим плазмиды ДНК в подобластях куриного сомитов или нервных трубок. Концентрация плазмиды регулируется для получения одного трансфекции клеток. Затем мы позволить клеткам развиваться в клональных популяций.
Abstract
Центральной темой в биологии развития, является диверсификация линий и выяснение основных молекулярных механизмов. Это влечет за собой тщательный анализ судьбы отдельных клеток в норме и при экспериментальных условиях. С этой целью трансфекции методы, ориентированные одного прародителями являются необходимым условием. Мы описываем здесь технически простой метод трансфекции клеток в одной куриной ткани-ово, позволяя надежной линии трассировки, а также генетических манипуляций. Конкретные области ткани направлены в сегмент или нервной трубки, и ДНК вводится непосредственно в эпителии интерес, в результате спорадических трансфекции отдельных клеток. Использование репортеров, клональной населению, могут, следовательно, быть прослежены на срок до трех дней, и поведение генетически модифицированных клональной популяции могут быть по сравнению с контролем. Этот метод использует преимущества доступности куриного эмбриона, а также новые инструменты для генетических манипуляций. Мы сравниваем и обсудить его преимущества по сравнению с широко используемым методом электропорации, и возможные применения и использования в дополнительной в естественных условиях модели также предложил. Мы выступаем за использование этого метода, как существенное дополнение и дополнить существующие линии отслеживания и генетических инструментов вмешательства.
Protocol
Discussion
Описанный выше метод является модификацией ранее описанной техники для доставки липофильных красителей малого подмножества клеток или одной прародителей 3. Она имеет три основных преимущества по сравнению со стандартной техникой электропорации. Во-первых, она предоставляет ср…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Шломи Криспин для нейронных ЭОП. В частности, мы признаем, Юваль Корица для начала технику GFP трансфекции. Эта работа была поддержана грантами от Израиля научного фонда, ассоциации Francaise контр ле Миопатии и Deutche Forschungsgemeinshaft, совместные научно-исследовательский центр 488 до CK
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. . Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
