בידוד של תאים אנדותל valvular
Summary
אנו מספקים שיטה בידוד אוכלוסיות culturing טהור של שסתום הלב תאים אנדותל (VEC). VEC יכול להיות מבודד צדי סף או העלעל ומיד הבאה, תא ביניים הבסיסית (ויק) בידוד היא פשוטה.
Abstract
שסתומי הלב הוא האחראי הבלעדי לשמירה על זרימת דם חד כיווני דרך מערכת הלב וכלי הדם. דקים אלה, סיבי רקמות חשופים מדגיש מכני משמעותי כפי שהם לפתוח ולסגור כמה מיליארדי פעמים על תוחלת חיים. סיבולת מדהימה של רקמות אלה נובע valvular התושב האנדותל (VEC) ותאי ביניים (ויק), כי כל הזמן לתקן לשפץ בתגובה לאותות מכני ביולוגי המקומית. רק לאחרונה התחלנו להבין את התנהגות ייחודית של תאים אלה, אשר בניסויים במבחנה יש תפקיד מפתח. מאתגר במיוחד הוא בידוד תרבות VEC. טיפול מיוחד יש להשתמש מרגע רקמה יוסר המארח באמצעות ציפוי הסופי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים בידוד ישיר, בידוד צד מסוים, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של VEC. אנו משתמשים עיכול אנזימטי ואחריו טכניקה גירוד עדין ספוגית כדי לסלק משטח תאים בלבד. תאים אלו נאספים אז לתוך צינור ו centrifuged לתוך גלולה. גלולה היא resuspended אז מצופה לתוך צלוחיות תרבות טרום מצופה מטריצה אני קולגן. פנוטיפ VEC הוא אושר על ידי מגע עכבות הצמיחה ביטוי של סמנים ספציפיים כגון PECAM1 האנדותל (CD31), פון Willebrand Factor (vWF), ואת הביטוי השלילי של אקטין אלפא שריר חלק (α-SMA). המאפיינים של פונקציונלי VEC קשורים עם רמות גבוהות של LDL acetylated. בניגוד לתאי אנדותל כלי הדם, VEC יש יכולת ייחודית להפוך mesenchyme, אשר בדרך כלל מתרחשת במהלך היווצרות שסתום עובריים 1. זה יכול להתרחש גם במהלך ומחוברות משמעותית לפרסם ממושך בתרבות חוץ גופית, ולכן הטיפול צריך להיעשות כדי המעבר ליד או מפגש. לאחר בידוד VEC, אוכלוסיות טהור של ויק אז יכול להיות נרכש בקלות.
Protocol
Discussion
הבנה של הביולוגיה valvular נפגעה על ידי קשיים טכניים בידוד אוכלוסיות culturing טהור של בתאי האנדותל valvular. טכניקות בידוד אופייניים לערב עיכול אנזימטי של מטריקס הבסיס הבסיסי או כימי דיסוציאציה של אג"ח דבק אנדותל 2,3. ניסויים ראשוניים בידוד איכותית הוערכו על ידי סוכנים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי פרס קריירה NSF, הקרן Hartwell, ואת איגוד הלב האמריקני (# 0830384N).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N. Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro. Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).
- Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
- Cheunyg, W. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).
- Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).
- Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves. Circ Res. 96, 792-799 (2005).
- Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).
- Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2. Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Shi, Q. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 107, 1164-1169 (2003).
