Summary
Nós fornecemos um método para isolar e populações de cultura pura de células endoteliais válvula cardíaca (VEC). VEC pode ser isolado de ambos os lados da cúspide ou folheto e imediatamente a seguir, a célula intersticial subjacente isolamento (VIC) é simples.
Abstract
Válvulas do coração é o único responsável por manter o fluxo sanguíneo unidirecional através do sistema cardiovascular. Esses finos, tecidos fibrosos são submetidos a tensões mecânicas significativas como abrir e fechar vários bilhões de vezes ao longo de uma vida. A resistência incrível destes tecidos é devido ao valvular residente endotelial (VEC) e células intersticiais (VIC) que constantemente reparação e remodelação em resposta a sinais locais mecânico e biológico. Apenas recentemente nós começamos a compreender os comportamentos ímpares dessas células, para o qual a experimentação in vitro tem desempenhado um papel fundamental. Particularmente desafiante é o isolamento e cultura de VEC. Cuidado especial deve ser usado a partir do momento em que o tecido é removido do host através de revestimento final. Aqui apresentamos os protocolos para o isolamento direto, o isolamento lado específico, cultura e verificação das populações puras de VEC. Usamos digestão enzimática seguido por uma técnica suave swab raspagem para retirar células da superfície somente. Estas células são então coletadas em um tubo e centrifugado em um pellet. O pellet é ressuspenso em seguida, e banhado em frascos de cultura pré-revestida com colágeno da matriz I. Fenótipo VEC é confirmado pelo contato inibiu o crescimento ea expressão de marcadores endoteliais específicos, tais como PECAM1 (CD31), fator de von Willebrand (vWF), e expressão negativa de alfa-actina de músculo liso (α-SMA). As características funcionais do VEC estão associados com altos níveis de LDL acetilada. Ao contrário de células endoteliais vasculares, VEC tem a capacidade única de transformar em mesênquima, que normalmente ocorre durante a formação embrionária válvula 1. Isso também pode ocorrer durante significativamente confluentes pós prolongada na cultura in vitro, assim que o cuidado deve ser feito para passagem em ou perto de confluência. Após o isolamento VEC, populações puras de VIC podem ser facilmente adquiridos.
Protocol
Discussion
Uma compreensão da biologia valvular tem sido prejudicada por dificuldades técnicas de isolamento e as populações de cultura pura de células endoteliais valvular. Técnicas de isolamento típico envolvem digestão enzimática da matriz subjacente basal ou dissociação química de ligações adesivas endotelial 2,3. Experimentos de isolamento preliminares foram avaliados qualitativamente por diferentes agentes dissociação e períodos de incubação. Os resultados destes experimentos mostraram que EDTA …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é apoiada pela concessão de CARREIRA NSF, a Fundação Hartwell, e da American Heart Association (# 0830384N).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
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