Isolierung von Valvular Endothelzellen
Summary
Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von reinen Populationen von Herzklappen-Endothelzellen (VEC). VEC von beiden Seiten der Höcker oder Prospekt isoliert werden können und unmittelbar nach ist zugrundeliegenden interstitiellen Zellen (VIC) Isolierung einfach.
Abstract
Herzklappen sind allein verantwortlich für unidirektionale Blutfluss durch das Herz-Kreislauf-System. Diese dünne, faserige Gewebe zu erheblichen mechanischen Belastungen, wie sie öffnen und schließen mehrere Milliarden Mal im Lauf ihres Lebens ausgesetzt. Die unglaubliche Ausdauer dieser Gewebe ist aufgrund der ansässigen valvular Endothelzellen (VEC) und interstitiellen Zellen (VIC), die ständig repariert und neu zu gestalten als Reaktion auf lokale mechanische und biologische Signale. Erst vor kurzem haben wir begonnen, das einzigartige Verhalten dieser Zellen, für die in vitro Experimente eine wichtige Rolle gespielt hat, zu verstehen. Besonders herausfordernd ist die Isolierung und Kultivierung von VEC. Besondere Sorgfalt verwendet ab dem Zeitpunkt der Gewebe vom Host bis zur endgültigen Beschichtung entfernt werden. Hier präsentieren wir Protokolle zur direkten Isolierung, Seite spezifische Isolierung, Kultur, und die Überprüfung der reinen Populationen von VEC. Wir verwenden enzymatische Verdauung durch eine sanfte Tupfer Schabetechnik nur oberflächlichen Zellen verdrängen gefolgt. Diese Zellen werden dann in ein Röhrchen gesammelt und zentrifugiert zu einem Pellet. Das Pellet wird dann resuspendiert und in Kulturflaschen vorbeschichtet mit Kollagen I-Matrix. VEC-Phänotyp wird durch den Kontakt bestätigt gehemmt Wachstum und die Expression von endothelialen spezifische Marker wie PECAM1 (CD31), Von-Willebrand-Faktor (vWF) und negative Expression von alpha-smooth muscle actin (α-SMA). Die funktionellen Eigenschaften von VEC sind mit hoher acetylierte LDL assoziiert. Im Gegensatz zu vaskulären Endothelzellen, haben VEC die einzigartige Fähigkeit, sich in Mesenchym, was normalerweise während der Embryonalentwicklung Ventil Formation 1 zu transformieren. Dies kann auch während der deutlich längeren Beitrag konfluent in vitro-Kultur auftreten, so ist darauf zu, um den Durchgang an oder nahe Einmündung erfolgen. Nach VEC Isolation, können reine Populationen von VIC dann leicht erworben werden.
Protocol
Discussion
Ein Verständnis der Herzklappen Biologie hat durch technische Schwierigkeiten Isolierung und Kultivierung reine Populationen valvular Endothelzellen beeinträchtigt wurde. Typische Isolierung Techniken beinhalten enzymatische Verdauung der zugrunde liegenden basalen Matrix oder chemische Spaltung von Endothelzellen Klebeverbindungen 2,3. Vorläufige Isolation Experimente wurden qualitativ durch unterschiedliche Dissoziation Agenten und Inkubationszeiten untersucht. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wird durch die NSF CAREER-Preis, der Hartwell-Stiftung und der American Heart Association (# 0830384N) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
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