판막병 내피 세포의 분리
Summary
우리는 분리하고 심장 밸브 내피 세포 (VEC)의 culturing 순수한 인구를위한 방법을 제공합니다. VEC는 (雨 期) 또는 전단지의 양쪽으로부터 격리하고 즉시 다음과 같은 수 있습니다 기본 중간 세포 (VIC) 격리는 간단합니다.
Abstract
심장 판막은 심장 혈관 시스템을 통해 단방향 혈액 흐름을 유지하는 책임은 전적으로 귀하에게 있습니다. 이 얇고 섬유질 조직들은 수명 동안 억 여러 번 열고 닫는 등 상당한 기계적 스트레스를 받게됩니다. 이러한 조직의 놀라운 인내력은 내피 거주 판막병 (VEC)와 중간 세포에 의한 (VIC)는 지속적으로 지방 기계 및 생물 학적 신호에 대한 응답으로 수리 및 개조. 최근 우리는 시험 관내 실험에서 중요한 역할을 담당해 왔습니다있는 이들 세포의 독특한 행동을 이해하기 시작했다. 특히 도전은 VEC의 격리와 문화입니다. 특별한주의는 순간부터 조직이 최종 도금을 통해 호스트에서 제거됩니다 사용해야합니다. 여기 우리는 직접적인 고립, 측면 구체적인 고립, 문화, VEC의 순수한 인구의 검증을위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 표면 세포를 이동시키다하는 부드러운 면봉 사장을 때릴 때의 기술 다음 효소 소화를 사용합니다. 이러한 세포는 다음 튜브에 수집하여 펠렛으로 centrifuged 있습니다. 펠렛은 다음 resuspended과 콜라겐 I 매트릭스 사전 코팅 문화 flasks로 도금입니다. VEC의 표현형가 접촉에 의해 확인하는 것은 성장과 같은 PECAM1 (CD31)로 내피 특정 마커의 표현을 저해, 폰 Willebrand 팩터 (vWF), 그리고 알파 – 부드러운 근육 굴지 (α – SMA)의 부정적인 표현. VEC의 기능적 특성은 acetylated LDL 높은 수준의와 관련된 있습니다. 혈관 내피 세포와는 달리, VEC는 일반적으로 배아 밸브 형성 한 동안 발생 mesenchyme로 변환하는 독특한 능력을했습니다. 이것은 또한 체외 문화에 크게 연장 게시물 합류하는 동안 발생할 수 있으므로주의가 합류 또는 가까운 통로로하여야한다. VEC 분리 후, VIC의 순수한 인구 그때 쉽게 취득하실 수 있습니다.
Protocol
Discussion
밸브 모양의 생물학의 이해는 분리 기술적인 문제 및 밸브 모양의 내피 세포의 culturing 순수 인구에 의해 장애인되었습니다. 일반 절연 기술 기본 기초 매트릭스 또는 내피 접착 채권 2,3의 화학 분해 효소의 소화를 포함. 예비 분리 실험은 질적으로 분리 직원과 부화 기간 변화에 의해 평가되었다. 이러한 실험의 결과는 최대 60 분 동안 그 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (또는 트립신 -…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NSF 경력 수상, 하트웰 재단, 그리고 미국 심장 협회 (# 0830384N)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N. Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro. Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).
- Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
- Cheunyg, W. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).
- Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).
- Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves. Circ Res. 96, 792-799 (2005).
- Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).
- Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2. Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Shi, Q. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 107, 1164-1169 (2003).
