Cryopreserving и восстановление клеток человека плюрипотентных использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

Summary

Этот протокол описывает подробную процедуру cryopreserving плюрипотентных клеток человека в нокаут среду криоконсервации SR и восстановления этих клеток в полной KnockOut SR подачи Free (КСР-FF), средний или подачи основе KnockOut SR среды.

Abstract

Открытие в 2006 году, что человеческие и мышиных фибробластов может быть перепрограммирован для получения плюрипотентных клетках ^1-3 с качествами, удивительно похожи на эмбриональные стволовые клетки создал новую ценную источником плюрипотентных клеток для открытия новых лекарств, клеточная терапия, и фундаментальных исследований.

GIBCO СМИ и реагенты были на переднем крае плюрипотентных исследований стволовых клеток в течение многих лет. Нокаут DMEM дополнен Нокаут сыворотки Замена средств по выбору для эмбрионального роста стволовых клеток, а теперь плюрипотентных клеточных культур ^3-9. Это золотой стандарт системы средств массовой информации теперь может быть использован для подачи без культуры с добавлением Knockout SR Коктейль фактор роста.

Традиционные человека плюрипотентных ES и методов клеточной культуры требует использования мыши или человека слоев фибробластов подачи или подачи с кондиционером среды. Эти культуры методы трудоемки, трудно масштабировать и трудно поддерживать бедра клетки недифференцированной из-за неопределенных условиях. Invitrogen разработала Нокаут SR фактор роста коктейль, чтобы позволить Вам легко перейти ваши бедра и культур ЭСК ячейки подачи без сохраняя при этом ваше использование Нокаут SR.

Protocol

Примечание: Для поддержания стерильных условиях культуры, все процедуры в данном протоколе проводятся с использованием стерильной лабораторной практики и проводится в соответствии ламинарном боксе. Перед началом, убедитесь, что любые средства массовой информации находится в равновесии до 37 ° С и надлежащим образом в газовых камерах. Подготовка Geltrex покрытием Блюда культуры Примечание: см. приложение для использования CELLstart покрытием блюда культуры. Оттепель одна трубка Geltrex (1 мл) медленно при температуре 2-8 ° С и разбавленных 1:100 она в 99 мл Нокаут D-MEM/F-12. Смешайте раствор нежно. Примечание: Некоторые линий плюрипотентных клеток могут требовать различные разведения Geltrex для оптимального роста. См. приложение для альтернативного разведения. Обложка всей поверхности каждой культуры блюдо с решением Geltrex (1 мл на 35-мм блюдо, 1,5 мл для 60-мм блюдо). Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения высыхания и инкубировать блюда в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Примечание: На данном этапе вы можете хранить Geltrex покрытием блюда культуры при 4 ° С в течение 1 месяца. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения Geltrex от высыхания. Перед началом использования, передачи Geltrex покрытием блюда ламинарном боксе и позволит им, чтобы уравновесить до комнатной температуры (около 1 часа). Подготовка Полное питатель-Free SR KnockOut среднего Для приготовления 1 мл 10 мкг / мл Базовое решение FGF, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до 6 месяцев. Основные FGF 10 мкг D-PBS 990μL 10% BSA 10 мкл Примечание: BSA может быть заменен или HSA Нокаут SR на той же концентрации. Для подготовки 50 мл 2 мг / мл Dispase решение, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Фильтры стерилизации раствора и хранить при 4 ° С в течение 2 недель. Dispase 100 мг D-PBS 50 мл Для подготовки 100 мл полной SR KnockOut питатель-Free (КСР-FF) асептически объединить компоненты, перечисленные в таблице ниже. Компонент Концентрация сток Конечная концентрация Объем Нокаут DMEM/F12 (кат. нет. 12660-012) – 1X 76,8 мл GlutaMAX-I (кат. № 35050-061) 200 мМ 2 мМ 1 мл KnockOut SR (кат. нет. 10828-028) – 20% 20 мл KnockOut SR-GFC (кат. нет. A10580-01) 50X 1X 2 мл bFGF (кат. нет. PHG0024). 10 мкг / мл 20 нг / мл 200 мкл Вы можете хранить KSR-FF среде при температуре 2-8 ° С не более одной недели. Перед предварительно уравновешивающая полной среде с температурой и газами, асептически добавить необходимый объем 2 меркаптоэтанол (55 мМ фондовом концентрация) для 0,1 ммоль конечной концентрации. Например, чтобы подготовить 100 мл KSR-FF средний добавить 182 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанол (1:550 разведение) Кроме того, 2-меркаптоэтанол могут быть добавлены к 1X завершены средние и хранить при температуре 2-8 ° С не более одной недели. Подготовка Замораживание / Криоконсервация среднего Криоконсервация среда состоит из двух средств массовой информации; Замораживание среднего и морозильные Б. Средний Они будут добавлены к клеткам в разное время и должны оставаться разделены. Каждый из них 50% от общего объема Криоконсервация Средний необходимости. Общий объем Криоконсервация Средний необходимо, так это 1 мл для каждого флакона должны быть заморожены. 90% сливной 60мм блюдо чЭСК могут быть использованы для банка 2 флаконов чЭСК в криоконсервации СМИ. Подготовка достаточного объема каждого Замораживание среды с дополнительными 2-5 мл для обеспечения превышения. Замораживание среднего (50% от конечного объема): 50% DMEM/F12 50% КСР Замораживание среднего B (50% от конечного объема): 80% DMEM/F12 20% ДМСО Пример: Если вы замораживания 20 флаконов клетки, вам необходимо 20 мл Криоконсервация Средний. Добавить 4 мл за превышения в общей сложности 24mL Средний Криоконсервация. Это означает, что вам нужно 12 мл замораживания среднего (50% 24mL) и 12 мл замораживания B среднего (50% 24mL). Замораживание среднего (12 мл): 6 мл DMEM/F12 6 мл KSR Замораживание среднего B (12 мл): 9,6 мл DMEM/F12 2,4 мл ДМСО Окончательный состав Криоконсервация среднего составляет 65% DMEM/F12, 25% КСР, а 10% ДМСО. Cryopreserving iPSCs Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется. Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. Обратитесь к таблице 1below подробнее об объемах требуется. Аспирируйте провел среды из сосуда для культивирования с помощью пипетки, и промойте клетки дважды с D-PBS. Аккуратно добавить подогретого Dispase решение культуры судна (например, 1 мл раствора на Dispase 60-мм культуры блюдо). Swirl культуры судна, чтобы покрыть всю поверхность клетки. Инкубируйте культуру судна при температуре 37 ° С в течение 3 минут. Удалить сосуд из инкубатора, аспирация Dispase решение, и осторожно мыть клетки с D-PBS. Аккуратно очистить клетки с поверхности культуры блюдо, используя сотовый скребок и передачи клеткам стерильные 15 мл центрифужную пробирку. Промыть культуры блюдо дважды с KSR-FF, мягко "распыления от" любой клетки, которые не отделены. Бассейн промыть среды с клетками в 15 мл трубки. Центрифуга трубке при 200 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре до гранул клеток. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая осадок клеток и отбросить его. Подготовить достаточное количество криопробирки. Как только клетки находятся в контакте с ДМСО, они должны быть аликвоты и замороженные в течение 2-3 минут. Аккуратно вылить содержимое трубки, чтобы полностью вытеснить клеточный осадок из трубки дно и вновь приостановить клеток в Замораживание А. среды [, осторожно пипетирования вверх и вниз с помощью 5-мл серологические пипетки]. После однородной суспензии сгустков, добавляют равный объем Замораживание В средней до этого, в капле мудрым образом, мягко закрученного клеточную суспензию перемешать. Примечание: На данном этапе клетки находятся в контакте с ДМСО, и работа должна быть выполнена эффективно. Как только клетки находятся в контакте с ДМСО, они должны быть аликвоты и замороженные в течение 2-3 минут. Алиготе 1 мл клеточной суспензии в каждый криопробирку. Быстро место флаконов в морозный г-н [быстро заморозить] и перенести его на -80 ° С в течение ночи. После ночи хранения при температуре -80 ° С, передача клетки резервуар жидкого азота для длительного хранения. IPSC оттепели флакон и восстановления клеток Примечание: KSR-FF может быть заменен KSR-содержащих MEF-кондиционированной среды, или KSR средой для использования с фидеров. См. приложение к инструкции по подготовке средств массовой информации. Предварительно 10 мл теплой KSR-FF среды в 50 мл трубки. Уравновесить соответствующим количеством Geltrex покрытием блюд до комнатной температуры и аспирации жидкости из любого блюда непосредственно перед покрытием выГ клеток. Осторожно снимите чЭСК (или IPSC) флакон с жидкой резервуар для хранения азота. Быстро размораживайте флакон клеток в 37 ° С водяной бане, пока только небольшой кусок замороженного остается во флаконе. Спрей флакон с 70% изопропанола для обеззараживания его и перенести его на стерильную капот культуры ткани. Асептических условиях передачи все содержимое флакона в 15 мл коническую трубку с помощью 5 мл пипетки. Промойте флакон с 1 мл KSR-FF и добавьте к 15 мл центрифужную пробирку. Медленно, добавить 4 мл KSR-FF каплям к ячейкам в 15 мл коническую трубку. При добавлении среде, мягко перемещать зонд вперед и назад, чтобы смесь клеток. (Это уменьшает осмотический шок для клеток). Центрифуга 15 мл трубки с клеточной суспензии при 1000rpm (200 х г) в течение 2 минут при комнатной температуре. Тщательно аспирации и отбросить супернатант, не нарушая клеточный осадок. Повторное приостановить осадок клеток в подогретого KSR-FF (например 4mL/60 мм блюдо) с помощью 5 мл пипетки и осторожно пипеткой клетки вверх и вниз, пока осадок клеток полностью рассеялись. Жизнеспособность более 70%, как ожидается, поэтому если жизнеспособность составляет менее 70%, это может занять больше времени для клеток достичь слияния. Используя ту же пипетку, передачи клеточной суспензии по каплям к Geltrex покрытием культуры блюдо предварительно доведены до комнатной температуры. Место культуры блюдо в 37 ° С инкубатор, с влажной атмосфере от 4 до 6% СО 2 в воздухе. Тщательно водоворот судна в направлении с севера на юг, с востока на запад шаблон, чтобы равномерно распределить клетки. Аккуратно жидкостью изменить культуру блюдо 24 часа после оттепели и ежедневно после этого удалить ячейки мусором, а также предоставить свежие питательные вещества, пока блюдо составляет примерно 70-80% вырожденная. Для сохранения культуры и пассажи ваш плюрипотентных клеток, обратитесь к нашему протокол под названием "питатель-Free культуры и пассажи плюрипотентных клеток человека использовании Полное KnockOut сыворотки Замена подачи среды без" Ожидаемые результаты Клетки должна быть примерно 70-80% сливной до криоконсервации. Dispase пищеварения результатов в керлинг и складывания колоний вдоль колонии полей. После сбора урожая клетки они заморожены как маленькие сгустки в криоконсервации СМИ. Как только флакон оттаяли, восстановить клетки и приложить к предварительно покрытых блюдо как небольшие пряди. Они растут быстро, ведущие к сливной блюдо в 5-6 дней. Таблица 1 – Рекомендуемые объемы Компонент 35 блюд Блюдо 60 мм Блюдо 100 мм Полное KnockOut SR среда 2 мл 4 мл 10 мл Решение Geltrex 1 мл 1,5 мл 4-5 мл Dispase 0,5 мл 1 мл 3-4 мл D-PBS для полоскания 2 мл 4 мл 10 мл Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть приложение .

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Knockout DMEM/F12			12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)
KnockOut Serum Replacement			10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail			A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg			PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercaptoethanol			21985-023
Dispase			17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL			A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium			14190-144
DMSO, 500mL		JT Baker	JT9224-1
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60 mm Tissue Culture treated dishes
Liquid nitrogen storage tank
Isopropanol freezing containers
1.5 mL Cryovials