ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير
Summary
في كثير من الحالات السريرية والبيولوجية وأنه من المفيد لدراسة العمليات الخلوية لأنها تتطور في المكروية وطنهم. نحن هنا وصف التجمع ، واستخدام المجهر الألياف البصرية المنخفضة التكلفة التي يمكن أن توفر الوقت الحقيقي التصوير في خلية ثقافة والدراسات الحيوانية ، والدراسات السريرية المريض.
Abstract
كثير من الدراسات السريرية والبيولوجية وتتطلب دراسة وتحليل طولية الشكل والوظيفة لقرار المستوى الخلوي. تقليديا ، يتم تشغيل تجارب متعددة في موازاة ذلك ، مع إزالة عينات فردية من هذه الدراسة في وقت نقاط متتابعة لتقييم بواسطة المجهر الضوئي. وقد تم تطوير تقنيات intravital عدة ، مع مبائر ، multiphoton ، والفحص المجهري التوافقي second يتظاهرون جميع قدرتهم على استخدامها في التصوير في الموقع 1. مع هذه الأنظمة ، ومع ذلك ، فإن البنية التحتية المطلوبة هي عملية معقدة ومكلفة ، والتي تشمل نظم الليزر والمسح الضوئي ومصادر الضوء المعقدة. هنا نطرح على بروتوكول لتصميم وتجميع لmicroendoscope ذات الدقة العالية التي يمكن أن تبنى في يوم واحد باستخدام الجاهزه – مكونات تحت 5،000 دولار أمريكي. منصة يوفر مرونة من حيث دقة وضوح الصورة ، الحقل من رأي ، وتعمل الطول الموجي ، ونحن تصف كيف يمكن تعديل هذه المعلمات بسهولة لتلبية الاحتياجات المحددة للمستخدم النهائي.
لقد اكتشفنا وغيرهم على استخدام microendoscope عالية الدقة (HRME) في المختبر في زراعة الخلايا 2-5 ، في 6 استئصاله والأنسجة الحية الحيوانية 2،5 ، والأنسجة البشرية في الجسم الحي 2،7. وأفاد شاهد على استخدام عدة عوامل التباين الفلورسنت مختلفة ، بما في ذلك بروفلافين 2-4 ، benzoporphyrin المشتقة خاتم monoacid A 5 (BPD – MA) ، و 6،7 fluoroscein ، والتي تلقى كامل ، أو موافقة من ادارة الاغذية والعقاقير الفحص لاستخدامها في البشر. عالية الدقة microendoscopy ، في شكل الموصوفة هنا ، قد نداء الى مجموعة واسعة من الباحثين العاملين في مجال العلوم الأساسية والسريرية. هذه التقنية تتيح مقاربة فعالة واقتصادية ، التي تكمل التقليدية المجهري الفوق ، من خلال تمكين المستخدم من أداء عالية الدقة ، والتصوير الطولي في الموقع.
Protocol
Discussion
وصف microendoscopy تقنية عالية القرار ينص هنا الباحثين في مجالات البحوث الطبية الحيوية الأساسية والسريرية مع طريقة مرنة وقوية وفعالة من حيث التكلفة لتصور بالتفصيل الخلوية في الموقع. وقد وصفت لدينا بروتوكول لتجميع نظام التصوير وأظهر استخدامها في زراعة الخلايا في المختبر ، والحيوان ، والأنسجة البشرية في الجسم الحي. في حين أن نتائج التصوير المقدمة هنا تستخدم بروفلافين كعامل النقيض الفلورسنت ، وقد أثبتت جماعات أخرى إصدارات نظام الإضاءة LED مع موجات والمرشحات المختارة لمباراة الإثارة / الانبعاثات أطياف الأصباغ الأخرى 5-7.
في البداية يتم تحديد القرار والنظر في الميدان من جانب تباعد الأساسية إلى النواة وقطرها التصوير من حزمة من الألياف البصرية. وقد استخدمنا حزم مع ما يقرب من 4 تباعد الجوهرية الأساسية ميكرون ، وبأقطار من 330 ميكرومتر التصوير (فيلم 1) ، 720 ميكرون (الشكل 2 ، الشكل 3A ، ب) ، و 1400 ميكرون (الشكل 3C). يمكن أن ينتقل عن طريق حزم أصغر الإبر أضيق قياس وبشكل ملحوظ أكثر مرونة من أكبر الألياف. نحن وآخرون 8 ، في بعض الحالات ، لاحظت ظهور انبعاثات تألق ذاتي من ألياف الحزمة نفسها. عند محاولة لإثارة موجات الأشعة فوق البنفسجية في fluorophores ، أو جمع الانبعاثات في النطاق الطيفي حمراء ، ينبغي إيلاء الاهتمام إلى مستوى تألق ذاتي حزمة الألياف المساهمة في إشارة الشاملة قياسه.
في حين أن معظم أعمال microendoscopy عالية الدقة وذكرت إلى الآن لم تستخدم حزمة الألياف العارية ، يمكن تقديم التكبير إضافية عن طريق استخدام العدسات غرين المستعبدين إلى الطرف البعيد. العدسات غرين توفر وسيلة مباشرة واقتصادية لزيادة دقة المكاني ، على الرغم من الاعتراف أيضا تعرضها للالانحرافات البصرية وNA محدودة. يمكن إذا غرين الأداء عدسة غير كافية لتطبيق معين ، غرين الهجين / الأهداف عدسة كروية مصغرة 9 أو التجمعات عدسة يكون الهدف العاملين 10-11.
وصف microendoscope عالية الدقة هنا أساسا تعمل بوصفها ومضان المجهر البرنامج الموسع للتمنيع واسعة المجال ، وبالتالي لا sectioning البصري (كما في المجهر مبائر أو غير الخطية) ليكون هو متوقع. في تجربتنا ، وذلك باستخدام 455 نانومتر ضوء الإثارة وبروفلافين موضعي كعامل النقيض من ذلك ، يتم جمعها في المقام الأول من الضوء على عمق المقابلة لطبقات الخلايا قليلة.
يجب على هذا البروتوكول لتمكين القارئ لتجميع microendoscope عالية الدقة على الفوق ، مع مساحة صغيرة من 10 "× 8". إذا رغبت في ذلك ، قد يتم تضمينه في النظام في خانة والمكونات الكهربائية (الصمام والكاميرا) مدعوم من البطارية (1D الشكل). يمكن أن تعمل بالطاقة العديد من الكاميرات المدمجة التي IEEE – 1394 (السلك الناري) ومنافذ USB لجهاز الكمبيوتر المضيف.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومولت جزئيا هذا البحث من المعاهد الوطنية للصحة ، ومنحة R01 EB007594 ، ووزارة الدفاع سرطان الثدي برنامج البحوث واقتراح BCO74699P7 ، ومؤسسة سوزان جي كومين منح 26152/98188972.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | ||
| LED | Thorlabs | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
| Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
| Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
| Dichroic mirror | Chroma | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
| Objective lens | Thorlabs (Olympus) | RMS 10X | ||
| Tube lens | Thorlabs | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD | |
| Condenser lens | Thorlabs | ACL2520 | ||
| Cage cube unit | Thorlabs | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | ||
| Cage rods and plates | Thorlabs | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | ||
| Fold mirror unit | Thorlabs | KCB1, PF10-03-G01 | ||
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | ||
| Adapters / couplers | Thorlabs | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | ||
| SMA connectors | Thorlabs | SM1SMA, 11040A | ||
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B TPS001 | ||
| Fiber optic bundle | Sumitomo | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |
References
- Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer. Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).
- Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. High-resolution imaging in Barrett’s esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope. Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).
- Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett’s esophagus. J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).
- Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring. Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).
- Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope. J. Microsc. 207, 108-117 (2002).
- Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -. L., Sojic, N. Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle. Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).
- Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles. Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).
- Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).
- Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope. Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).
- Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems. Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).
