Em muitas situações biológicas e clínicas, é vantajoso para estudar os processos celulares como eles evoluem no seu microambiente nativa. Aqui, descrevemos a montagem e uso de um microscópio de baixo custo de fibra óptica que pode fornecer imagens em tempo real em cultura de células, estudos em animais e estudos clínicos do paciente.
Muitos estudos biológicos e clínicos requerem o estudo longitudinal e análise da morfologia e função com resolução nível celular. Tradicionalmente, experiências múltiplas são executados em paralelo, com amostras individuais retirado do estudo em momentos sequenciais para avaliação por microscopia de luz. Várias técnicas foram desenvolvidas intravital, com confocal, multifotônica, e microscopia segundo harmônico todos demonstrando sua capacidade de ser usado para geração de imagens em uma situ. Com estes sistemas, no entanto, a infra-estrutura necessária é complexo e caro, envolvendo sistemas de varredura a laser e complexas fontes de luz. Aqui apresentamos um protocolo para a concepção e montagem de um microendoscope de alta resolução que pode ser construída em um dia utilizando off-the-shelf componentes para EUA em US $ 5.000. A plataforma oferece flexibilidade em termos de resolução de imagem, o campo de visão, operacional e comprimento de onda, e descrevemos como esses parâmetros podem ser facilmente modificados para atender às necessidades específicas do usuário final.
Nós e os outros têm explorado o uso do microendoscope de alta resolução (HRME) em cultura de células in vitro 2-5, em 6 excisadas e tecidos de animais vivos 2,5, e em tecidos humanos in vivo 2,7. Usuários relataram o uso de diferentes agentes de contraste fluorescente, incluindo proflavina 2-4, benzoporfirina derivados anel monoacid A 5 (BPD-MA), e fluoroscein 6,7, os quais têm recebido total, ou aprovação de investigação do FDA para uso em seres humanos. De alta resolução microendoscopy, na forma descrita aqui, pode apelar para uma ampla gama de pesquisadores que trabalham nas ciências básicas e clínicas. A técnica oferece uma abordagem eficaz e econômica que complementa microscopia tradicional bancada, permitindo ao usuário realizar de alta resolução, imagem longitudinal in situ.
A alta resolução técnica microendoscopy aqui descrito fornece aos pesquisadores em áreas básicas da pesquisa biomédica e clínica com um método flexível, robusto e de baixo custo para a visualização de detalhes celulares in situ. Nós descrevemos um protocolo para a montagem do sistema de imagem e demonstrou a sua utilização em cultura de células in vitro e em animais e tecidos humanos in vivo. Embora os resultados aqui apresentados imagem usada proflavina como um agente de contraste fluorescente, outros grupos têm demonstrado versões do sistema com comprimentos de onda de iluminação LED e filtros escolhida para coincidir com excitação / emissão de espectros de outros corantes 5-7.
Resolução e campo de visão são inicialmente determinado pelo espaçamento core-to-core e diâmetro de imagem do feixe de fibra óptica. Temos usado pacotes com aproximadamente 4 mm de espaçamento central-core, e diâmetros de imagem de 330 mM (filme 1), 720 mM (Figura 2, Figura 3a, b), e 1400 mM (Figura 3c). Os feixes menores podem ser passadas através de agulhas bitola estreita e são significativamente mais flexível do que as fibras maiores. Nós e outros oito têm, em alguns casos, notou o aparecimento de emissões de autofluorescência da fibra pacote em si. Ao tentar excitar fluoróforos em comprimentos de onda ultravioleta, ou recolher as emissões na faixa vermelha do espectro, a atenção deve ser dada ao nível de autofluorescência de fibra pacote contribuindo para o sinal total medido.
Enquanto a maioria do trabalho microendoscopy alta resolução relatada até o momento, tem utilizado um feixe de fibras nuas, ampliação adicional pode ser fornecida pelo uso de lentes GRIN ligados à ponta distal. Lentes GRIN oferecem uma maneira simples e econômica para aumentar a resolução espacial, embora a sua suscetibilidade a aberrações ópticas e NA limitada é bem reconhecida. Se o desempenho da lente GRIN é inadequado para uma determinada aplicação, GRIN híbrido / objectivos lente esférica 9 ou conjuntos de lentes objetivas 11/10 miniatura podem ser empregadas.
O microendoscope de alta resolução aqui descrito opera essencialmente como um grande campo do microscópio epi-fluorescência, portanto não seccionamento óptico (como em microscopia confocal ou não linear) é de se esperar. Em nossa experiência, utilizando 455 nm e luz de excitação proflavina tópica como agente de contraste, a luz é coletada principalmente a partir de uma profundidade correspondente a algumas camadas de células.
Este protocolo deve permitir que o leitor a montar o microendoscope de alta resolução sobre a bancada, com um tamanho compacto de 10 "x 8". Se desejar, o sistema pode ser colocado em uma caixa e os componentes elétricos (LED e uma câmera) alimentado por uma bateria (Figura 1d). Muitas câmeras compactas pode ser alimentado pelo IEEE-1394 (Firewire) e portas USB do computador host.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi parcialmente financiada pelo National Institutes of Health, conceder R01 EB007594, o Departamento de Defesa Programa de Pesquisa em Câncer de Mama, proposta BCO74699P7, ea Susan G. Komen Foundation conceder 26152/98188972.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | ||
LED | Thorlabs | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Dichroic mirror | Chroma | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Objective lens | Thorlabs (Olympus) | RMS 10X | ||
Tube lens | Thorlabs | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD | |
Condenser lens | Thorlabs | ACL2520 | ||
Cage cube unit | Thorlabs | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | ||
Cage rods and plates | Thorlabs | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | ||
Fold mirror unit | Thorlabs | KCB1, PF10-03-G01 | ||
Lens tubes | Thorlabs | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | ||
Adapters / couplers | Thorlabs | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | ||
SMA connectors | Thorlabs | SM1SMA, 11040A | ||
LED driver | Thorlabs | LEDD1B TPS001 | ||
Fiber optic bundle | Sumitomo | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |