Summary

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

Published: October 18, 2010
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Klebeband-basierten Ansatz für die Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen durch schnelles ganze Zelle Erkennung gefolgt<em> Salmonellen</em> Mittels Fluoreszenz<em> In situ</em> Hybridisierung (FISH).

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für Klebeband-basierte Probenahme von Tomaten und anderem Frischobst und Frischgemüse Oberflächen, durch on-tape-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) für die schnelle Kultur-unabhängigen Nachweis von Salmonella spp. Cell-geladenen Bänder können auch verdeckt auf Selektivagar für Festphasen-Anreicherung gelegt werden, bevor die Erkennung. Alternativ kann mit geringem Volumen Flüssigkeit Anreicherungen (Flüssigkeitsoberfläche miniculture) auf der Oberfläche des Bandes in nicht-selektiven Brühe durch FISH und Analyse über die Durchflusszytometrie gefolgt durchgeführt werden. Um zu beginnen, sterile Klebeband ist in Kontakt mit frischen Produkten gebracht wird, wird sanfter Druck angewandt, und das Band entfernt wird, physisch Extrahieren Mikroben anwesend auf diesen Flächen. Tapes sind klebrig-Seite nach oben auf Objektträger aus Glas montiert und in der Stichprobe Zellen werden mit 10% igem Formalin (30 min) und entwässert mit einem abgestuften Ethanol-Reihe (50, 80 und 95%; 3 min jeder Konzentration) festgelegt. Als nächstes Zelle aufgeladen Bänder werden mit Puffer mit einem Salmonella-gezielte DNA-Sonde Cocktail gesichtet und hybridisiert für 15 bis 30 min bei 55 ° C, gefolgt von einer kurzen in einem Waschpuffer, um ungebundene Sonde zu entfernen spülen. Adhärente sind FISH-markierten Zellen werden dann mit den DNA-Farbstoff 4 ',6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) gegengefärbt und die Ergebnisse betrachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für Festphasen-Anreicherung, sind Zell-geladenen Bänder Gesicht nach unten auf einen geeigneten selektiven Agar-Oberfläche gelegt und inkubiert, um in situ Wachstum von Salmonella Mikrokolonien durch FISH und Mikroskopie verfolgt, wie oben beschrieben zu ermöglichen. Für flüssige Oberfläche miniculture sind Zell-geladenen Bänder klebrigen Seite nach oben und ein Silikon Perfusionskammer angewendet wird, so dass das Band und Objektträger bilden den Boden einer wasserdichten Kammer, in die ein kleines Volumen (≤ 500 ul) von Trypticase Soy Broth (TSB) wird eingeführt. Die Einlassöffnungen sind versiegelt und die Kammern sind bei 35 inkubiert – 37 ° C, so dass das Wachstum-basierte Amplifikation von Tape-extrahierten Mikroben. Nach der Inkubation Einlasskanäle entsiegelt worden sind, Zellen abgelöst und unter kräftigem wieder gemischt und her Pipettieren geerntet durch Zentrifugation und in 10% neutral gepuffertem Formalin. Schließlich sind die Proben hybridisiert und untersucht per Durchflusszytometrie, um das Vorhandensein von Salmonella spp offenbaren. Wie hier beschrieben, können unsere "Band-FISH"-Ansatz bietet eine einfache und schnelle Probenahme und Nachweis von Salmonellen auf Tomaten Oberflächen. Wir haben auch diesen Ansatz für die Probenahme andere Arten von frischen Produkten, einschließlich Spinat und Chilischoten verwendet.

Protocol

1. Oberflächenproben mit Sterile Klebeband Wählen Sie ein Band für die Probenahme zu verwenden. Die im Handel erhältlichen Fungi-Tape oder Con-Tact-It Probenahme Bänder sind steril und speziell verpackte für Benutzerfreundlichkeit. Allerdings haben wir festgestellt, dass transparent (optisch klar) generische Büro Band kann ebenfalls verwendet werden. Verwenden Sie einen Permanent-Marker auf 1 cm 2 Plätze auf der nicht-klebrige Seite eines 10 cm Stück Klebeband (ein Papier-Vorlage…

Discussion

Einfache und schnelle Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern auf Oberflächen erzeugen kann zu einer Abschwächung Lebensmittelinfektionen durch rechtzeitige und verwertbare Daten. Klebeband-basierte Methoden zur Probenahme in Umwelt-, Klinik-und Lebensmittel-Mikrobiologie, seit den 1950er Jahren verwendet und beinhalten Drücken von "Scotch"-Stil Band auf Oberflächen zur Entfernung von Mikroorganismen, gefolgt von direkten mikroskopischen Untersuchung oder die Übertragung von anhaftenden Mikroorganism…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen Grow Iowa Werte Fund Award an BFBS zur Verfügung gestellt.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Fungi-Tape sampling tape   Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL 745 http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape   Birko Corporation, Denver, CO   http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic   Various suppliers   Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface   Local grocery   Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth   Difco, Sparks, MD 211768 For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base   Difco, Sparks, MD 223420 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement   Difco, Sparks, MD 235310 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO HT5011 10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023 Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes   Various suppliers   RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA    
NaCl solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5150 Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9285 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO L4522 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes   Integrated DNA Technologies, Coralville, IA   5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge   Various suppliers   Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber   Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR PC1R-2.0 Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 05-408-151 Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station   Various suppliers   Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven   Boekel Scientific, Feasterville, PA Model 230300 Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer   Boekel Scientific, Feasterville, PA Model 240000 Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)   Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA H-1200 Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope   Various suppliers   Leitz Laborlux S used here
Digital camera   Various suppliers   Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software   Various suppliers   Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop   Adobe Inc.   For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer   Various suppliers   FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software   Various suppliers   FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used

References

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Cite This Article
Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce. J. Vis. Exp. (44), e2308, doi:10.3791/2308 (2010).

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