Summary

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

Published: October 18, 2010
doi:

Summary

Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda a<em> Salmonella</em> Usando fluorescência<em> In situ</em> Hybridization (FISH).

Abstract

Este protocolo descreve um método simples para adesiva-fita baseada em amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido em fita-hibridização fluorescente in situ (FISH) para detecção independente de cultura rápida de Salmonella spp. Fitas de células carregadas também podem ser colocados face para baixo em ágar seletivo para fase sólida de enriquecimento antes da detecção. Alternativamente, enriquecimentos de baixo volume de líquido (miniculture superfície do líquido) pode ser realizada sobre a superfície da fita em caldo não seletivo, seguido por FISH e análise através de citometria de fluxo. Para começar, fita adesiva estéril é colocada em contato com produtos frescos, uma leve pressão é aplicada, ea fita é removida, fisicamente extrair os micróbios presentes sobre estas superfícies. Fitas adesivas são montados lado-a em lâminas de vidro para microscópio e as células da amostra são fixados com formalina a 10% (30 min) e desidratados, utilizando uma série de etanol classificados (50, 80 e 95%; 3 min cada concentração). Em seguida, células carregadas fitas estão manchadas com tampão contendo uma Salmonella-alvo cocktail sonda de DNA e hibridização por 15 – 30 min a 55 ° C, seguido de uma breve lavagem em uma solução de lavagem para remover sonda não ligada. Aderente, FISH marcado células são então contrastado com o DNA de corante 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e os resultados são visualizados através de microscopia de fluorescência. Para o enriquecimento de fase sólida, célula carregada fitas são colocadas de face para baixo sobre uma superfície adequada agar seletivo e incubado para permitir o crescimento in situ de microcolônias Salmonella, seguido por FISH e microscopia, como descrito acima. Para miniculture superfície do líquido, células carregadas fitas são colocadas lado adesivo para cima e uma câmara de perfusão silicone é aplicado de modo que a fita eo formulário microscópio deslize a parte inferior de uma câmara estanque em que um pequeno volume (mL ≤ 500) de Trypticase Soy caldo (TSB) é introduzido. As portas de entrada estão fechados e as câmaras são incubadas a 35-37 ° C, permitindo o crescimento baseado em amplificação de fita-extraídos micróbios. Após a incubação, portas de entrada são selados, as células são separadas e misturadas com volta vigorosa e para trás pipetagem, colhidas através de centrifugação e fixados em 10% neutro tamponado. Finalmente, as amostras são cruzados e analisados ​​através de citometria de fluxo para revelar a presença de Salmonella spp. Como descrito aqui, o nosso "fita-FISH" abordagem pode fornecer amostragem simples e rápido e detecção de Salmonella em superfícies de tomate. Temos também utilizado esta abordagem para a amostragem de outros tipos de produtos frescos, incluindo espinafre e pimentas jalapeño.

Protocol

1. Amostragem de superfície com fita adesiva estéril Selecione uma fita de usar para a amostragem. O comercialmente disponíveis Fungi Tape-Con-Tact ou-It fitas de amostragem são estéreis e, especialmente embalados para facilidade de uso. No entanto, descobrimos que transparente (translúcido) fita escritório genéricos também podem ser usados. Use um marcador permanente para desenhar um centímetro 2 quadrados do lado não-pegajosa de um pedaço de 10 cm de fita adesiva (um modelo …

Discussion

Métodos simples e rápido para a detecção de patógenos em superfícies produzem podem ajudar a mitigar doenças transmitidas por alimentos, fornecendo dados em tempo útil e acionável. Adesiva métodos baseados em fita de amostragem têm sido usados ​​em microbiologia ambiental, clínico e alimentar desde a década de 1950 e envolvem pressionando de "Scotch" fita-de estilo para superfícies para remoção de microorganismos, seguido por exame microscópico direto ou transferência de microrganismos ad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiamento para este trabalho foi fornecida por um prêmio Grow Fundo Iowa Valores para BFBS.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Fungi-Tape sampling tape   Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL 745 http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape   Birko Corporation, Denver, CO   http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic   Various suppliers   Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface   Local grocery   Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth   Difco, Sparks, MD 211768 For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base   Difco, Sparks, MD 223420 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement   Difco, Sparks, MD 235310 For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO HT5011 10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023 Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes   Various suppliers   RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA    
NaCl solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5150 Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9285 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution   Sigma-Aldrich, St. Louis, MO L4522 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes   Integrated DNA Technologies, Coralville, IA   5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge   Various suppliers   Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber   Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR PC1R-2.0 Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 05-408-151 Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station   Various suppliers   Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven   Boekel Scientific, Feasterville, PA Model 230300 Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer   Boekel Scientific, Feasterville, PA Model 240000 Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)   Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA H-1200 Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope   Various suppliers   Leitz Laborlux S used here
Digital camera   Various suppliers   Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software   Various suppliers   Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop   Adobe Inc.   For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer   Various suppliers   FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software   Various suppliers   FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used

References

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Cite This Article
Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce. J. Vis. Exp. (44), e2308, doi:10.3791/2308 (2010).

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