والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية
Summary
بروتوكول للعزل وتفعيل أرومة النطفة من الذكور<em> C. ايليجانس</em> الموصوفة هنا. قطع نهاية الخلفي من أرومة النطفة النشرات الذكور. ويمكن تنشيط أرومة النطفة قبل إضافة البروتيني.
Abstract
الذكور والمخنثين هما الاستغلال الجنسي وجدت بشكل طبيعي في الديدان الخيطية جيم ايليجانس. ويتم إنتاج الحيوانات المنوية amoeboid من قبل كل من الذكور والمخنثين. في مرحلة مبكرة من تكون الأعراس ، والخلايا التناسلية من المخنثين تفرق في عدد محدود من الحيوانات المنوية — حوالي 300 — ويتم تخزينها في "حقيبة" صغيرة تدعى spermatheca. في وقت لاحق ، المخنثين انتاج البويضات باستمرار 1. في المقابل ، من الذكور حصرا إنتاج الحيوانات المنوية طوال مرحلة البلوغ. انتاج الحيوانات المنوية من الذكور بكثير بحيث تمثل 50 ٪> من مجموع خلايا في البالغين 2 دودة نموذجي. لذلك ، عزل الحيوانات المنوية من الذكور هو أسهل من ذلك من المخنثين من.
تتولد بشكل طبيعي إلا نسبة صغيرة من الذكور بسبب انفصال غير عفوية من كروموسوم X 3. معبر المخنثين مع الذكور أو أكثر سهولة ، وإدخال طفرات تثير له (نسبة عالية من الذكور) النمط الظاهري هي بعض الاستراتيجيات التي من خلالها يمكن للمرء أن تثري السكان الذكور 3.
ويمكن تمييزها بسهولة من الذكور المخنثين من خلال ملاحظة 4 مورفولوجيا الذيل. وأشار خنثى الذيل ، في حين أن يتم تقريب الذيل مع هياكل الذكور التزاوج.
قطع الذيل النشرات عدد كبير من أرومة النطفة المخزنة داخل الجهاز التناسلي للذكور. يتم إجراء تشريح تحت المجهر ستيريو باستخدام الإبر قياس 27. منذ ليست مرتبطة ماديا أرومة النطفة مع أي الخلايا الأخرى ، والضغط الهيدروليكي يطرد المحتويات الداخلية للجسم الذكر ، بما في ذلك أرومة النطفة 2.
يتم تشريح الذكور مباشرة على قطرة صغيرة من "متوسطة الحيوانات المنوية. أرومة النطفة حساسة للتغيير في درجة الحموضة. وبالتالي ، يتم استخدام HEPES ، وهو مركب مع قدرة التخزين المؤقت جيدة في وسائل الإعلام الحيوانات المنوية. الجلوكوز والأملاح الأخرى الموجودة في الحيوانات المنوية وسائل الاعلام المساعدة في الحفاظ على الضغط الاسموزي للحفاظ على سلامة الحيوانات المنوية.
ويطلق على مرحلة ما بعد الانتصافي تمايز أرومة النطفة المنوية في السائل المنوي تكون النطاف أو التنشيط. يهز 5 ، 6 ونيلسون وأظهرت في وقت سابق ان يمكن أن يتسبب أرومة النطفة في جولة على التمايز إلى الحيوانات المنوية وذلك بإضافة مركبات مختلفة بما في ذلك تفعيل E. Pronase هنا نظهر تكون النطاف في المختبر من C. أرومة النطفة ايليجانس باستخدام Pronase E.
تكون النطاف الناجح هو الشرط المسبق للخصوبة وبالتالي تكون النطاف في المسوخ المعيبة هي عقيمة. وقد أظهرت العديد من المسوخ حتى الآن ليكون معيبا على وجه التحديد في عملية تكون النطاف 7. وجدت خلال شذوذ في تفعيل المختبر من جمعية مهندسي البترول رواية (الحيوانات المنوية المعيبة) المسوخ من شأنه أن يساعدنا اكتشاف اللاعبين إضافية المشاركة في هذا الحدث.
Protocol
Discussion
بالإضافة إلى تحليل المسوخ جمعية مهندسي البترول ، وهذا البروتوكول لها تطبيقات هامة أخرى ، مثل تحليل مورفولوجيا الحيوانات المنوية مع الشيخوخة. ويمكن استخدام الحيوانات المنوية وأرومة النطفة معزولة باستخدام هذا البروتوكول في التجارب النهائية الاخرى مثل immunostaining من نو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر صموئيل وارد ، وتهز ديان جيم نيلسون غريغوري لهذه التقنية الرائدة. نشكر بافان Kadandale Geldziler وبريان لتنشيط الحيوانات المنوية فيديو يظهر فيها واعضاء مختبر لاجراء مناقشات مفيدة سينجسون ؛ لسلالات والمعاهد الوطنية للصحة CGC لدعم لنا من خلال منح (R01HD054681).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tuberculin syringe | Becton Dickinson | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
|
| Pap pen | Zymed | 00-8888 | ||
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides |
VWR International | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
|
| Cover glass | VWR International | 48366045 | ||
| Protease | Sigma | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. . Methods in Cell Biology. , 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. 유전학. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L’Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L’Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. 유전학. 138, 689-692 (1994).
