Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma
Summary
Ein Protokoll für die Isolierung und Aktivierung von Spermatiden von männlichen<em> C. elegans</em> Ist hier beschrieben. Cutting hinteren Ende des männlichen Versionen Spermatiden. Die Spermatiden kann durch Zugabe von Protease aktiviert werden.
Abstract
Männchen und Hermaphroditen sind die beiden natürlich vorkommende sexuelle Formen in dem Fadenwurm C. elegans. Die amöboiden Spermien werden sowohl Männchen als auch Hermaphroditen produziert. In der früheren Phase der Gametogenese, differenzieren die Keimzellen des Hermaphroditen in begrenzte Anzahl von Spermien – rund 300 – und sind in einer kleinen "Tasche" genannt Samentasche gespeichert. Später, Hermaphroditen kontinuierlich produzieren Eizellen 1. Im Gegensatz dazu produzieren Männer ausschließlich Samenzellen während ihres gesamten Erwachsenenalter. Die Männchen produzieren so viel Sperma, dass es für> 50% der gesamten Zellen in einer typischen erwachsenen Wurm 2 Konten. Deshalb isolieren Sperma von Männchen ist einfacher, als sich von Hermaphroditen.
Nur ein kleiner Teil der Männer sind von Natur erzeugt durch spontane nicht-Disjunktion von X Chromosom 3. Crossing Hermaphroditen mit Männchen oder komfortabel, die Einführung von Mutationen zu erheben, ihm zu geben (hohe Inzidenz von Rüden) Phänotyp sind einige der Strategien, durch die man die männliche Bevölkerung 3 bereichern können.
Männer können einfach von Hermaphroditen werden durch die Beobachtung der Schwanz Morphologie 4 aus. Zwitter Schwanz ist spitz, während die männlichen Schwanz mit passenden Strukturen abgerundet ist.
Cutting the tail Releases überwiegende Zahl der Spermatiden im männlichen Genitaltrakt gespeichert. Dissection wird unter einem Stereomikroskop mit 27-Gauge-Nadel durchgeführt. Da Spermatiden nicht physisch mit anderen Zellen verbunden, vertreibt hydraulische Druck internen Inhalt der männlichen Körpers, einschließlich Spermatiden 2.
Die Männchen sind direkt an einem kleinen Tropfen "Sperm Medium 'seziert. Spermatiden sind empfindlich gegenüber Veränderungen des pH-Wertes. Daher ist HEPES, eine Verbindung mit guter Pufferkapazität in Spermien Medien eingesetzt. Glucose und andere Salze, die in Spermien Medien zur Aufrechterhaltung des osmotischen Drucks, um die Integrität der Spermien zu erhalten.
Post-meiotischen Differenzierung der Spermatiden in Spermien ist Spermiogenese oder Sperma Aktivierung bezeichnet. Shakes 5 und 6 Nelson zuvor gezeigt, dass runden Spermatiden induziert werden können, in Spermien durch die Zugabe verschiedener aktivierende Verbindungen einschließlich Pronase E. Hier haben wir in vitro Spermiogenese von C. Beweis zu unterscheiden elegans Spermatiden mit Pronase E.
Erfolgreiche Spermiogenese ist Voraussetzung für die Fruchtbarkeit und damit die Mutanten in Spermiogenese sind steril. Bisher mehrere Mutanten konnte gezeigt werden, speziell in der Spermiogenese Verfahren 7 defekt. Abnormality gefunden während der in vitro Aktivierung der neuartigen Spe (Spermatogenese defekt) Mutanten würde uns helfen, zu entdecken zusätzliche Teilnehmer an dieser Veranstaltung.
Protocol
Discussion
Neben der Analyse Spe-Mutanten, hat dieses Protokoll andere wichtige Anwendungen, wie zB die Analyse Morphologie der Spermien mit zunehmendem Alter. Spermatiden und Spermien isoliert mit diesem Protokoll kann in anderen nachgeschalteten Experimenten wie verwendet werden, Immunfärbung von Wildtyp und Mutante Spermien 8, 9, Beweglichkeit der Spermien auf Objektträger 10, physiologische Messungen 9, 11 oder sogar künstliche Befruchtung 12.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Samuel Ward, Shakes Diane C. und Gregory Nelson für bahnbrechende dieser Technik. Wir danken Pavan Kadandale und Brian Geldziler für Videos, die aktiviert Spermien; Mitglieder der Singson Labor für hilfreiche Diskussionen, CGC für Stämme und NIH für die Unterstützung durch Grant (R01HD054681).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tuberculin syringe | Becton Dickinson | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
|
| Pap pen | Zymed | 00-8888 | ||
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides |
VWR International | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
|
| Cover glass | VWR International | 48366045 | ||
| Protease | Sigma | P-6911 |
References
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