アイソレーションと試験管内で活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子
Summary
男性から精子を分離し、活性化するためのプロトコル<em> C.エレガンス</em>ここで説明されています。男性のリリースの精子細胞の後端をカット。精子細胞は、プロテアーゼの添加によって活性化することができます。
Abstract
男性と雌雄同体の線虫 C. elegansの2つの自然に存在性的なフォームです。アメーバ精子は、男性と雌雄同体の両方で生産されています。約300 – – 配偶子形成の初期段階では、雌雄同体の生殖細胞は精子の数が限らへと分化し、貯精嚢と呼ばれる小さな"袋"に格納されています。その後、雌雄同体は、継続的に卵母細胞 1を生成する。対照的に、男性は自分の成人期を通じて独占的に精子生成。男性はそれが典型的な大人のワーム2の全細胞の> 50％を占めていることそんなに精子を生成する。したがって、男性から精子を分離する雌雄同体のものと比べて簡単です。
男性のわずかな割合は、自然にX染色体3の自発的な非分離のために生成されます。より便利に、男性またはで雌雄同体を横断、彼を生じさせる変異の導入（男性の発生率が高い）表現型は1つが男性の人口3を豊かにできるような戦略の一部です。
男性は、簡単に尾の形態4を観察することにより、雌雄同体と区別することができる。雄の尾部が嵌合構造で丸められるのに対し、両性具有の尾は、指摘されている。
テールをカットすると、雄の生殖器官の内部に格納されて精子細胞の膨大な数を解放します。解剖は、27ゲージの針を使用して実体顕微鏡下で行われる。精子細胞が物理的に他のセルと接続されていないので、油圧は精子2を含む男性の体の内部の内容を、排出します。
男性は、直接"精子の中"の小滴に解剖されています。精子は、pHの変化に敏感です。したがって、HEPES、良好な緩衝能を持つ化合物は、精子のメディアで使用されています。グルコースと精子のメディアに存在する他の塩は、精子の整合性を維持するために浸透圧を維持するのに役立ちます。
精子への精子の後の減数分裂分化は、精子や精子の活性化と呼ばれます。 5揺れ、そしてネルソン6以前に円形精子細胞はここでは、Cのin vitroでの精子で実証プロナーゼE.を含む様々な活性化合物を添加することにより精子に分化誘導できることを示したプロナーゼEを使用して線虫の精子
成功した精子は生殖能力の前提条件であり、したがって、精子形成の欠損変異株が無菌である。これまでいくつかの変異体は、特に精子形成の過程7で不良品であることが示されている。異常が小説SPE（精子形成の不良）のin vitroでの活性化に変異体は、私たちはこのイベントに参加する追加のプレーヤーを知る手助けになる際に発見。
Protocol
Discussion
SPE変異体を分析することに加えて、このプロトコルは、加齢に伴う精子の形態を分析するなど、他の重要なアプリケーションを、持っています。このプロトコルを使用して単離した精子と精子は野生型と変異体精子8、9、スライド10、生理学的測定9、11、あるいは人工授精12日の精子の運動性の免疫染色、などの他の下流の実験に使用することができます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、サミュエルウォードに感謝、ダイアンC.はこの手法を開拓するためシェイクスとグレゴリーネルソン。我々は、活性化精子を示すビデオをパヴァーヌKadandaleとブライアンGeldzilerに感謝、有用な議論のためのシンソンの研究室のメンバーは、CGC株とNIHの助成金（R01HD054681）を通じて私たちをサポートするために。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tuberculin syringe | Becton Dickinson | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
|
| Pap pen | Zymed | 00-8888 | ||
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides |
VWR International | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
|
| Cover glass | VWR International | 48366045 | ||
| Protease | Sigma | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. . Methods in Cell Biology. , 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. 유전학. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L’Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L’Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. 유전학. 138, 689-692 (1994).
