Summary

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Published: February 03, 2011
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur organotypischen Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden vorbereiten können. Hirnschnitten sind auf porösen Membranen und Kulturmedien ist erlaubt, um eine Schnittstelle bilden gelegt. Diese Methode schont die grobe Architektur des Hippocampus für bis zu 2 Wochen in Kultur.

Abstract

Der Hippocampus, einer Komponente des limbischen Systems, spielt eine wichtige Rolle in das Langzeitgedächtnis und die räumliche Navigation 1. Hippocampus-Neuronen können die Stärke ihrer Verbindungen nach kurzen starke Aktivierung ändern. Dieses Phänomen, das als Langzeit-Potenzierung (LTP) bekannt ist, kann für Stunden oder Tage dauern und ist mittlerweile der beste Kandidat Mechanismus für Lernen und Gedächtnis 2. Darüber hinaus hat der gut definierten Anatomie und Konnektivität des Hippocampus 3 hergestellt ist ein klassisches Modellsystem zur synaptischen Übertragung und synaptische Plastizität 4-Studie.

Als unser Verständnis der Physiologie des Hippocampus Synapsen wuchs und molekulare Spieler identifiziert wurde, wurde die Notwendigkeit, synaptischer Proteine ​​zu manipulieren unerlässlich. Organotypischen hippokampalen Kulturen bieten die Möglichkeit für eine einfache Genmanipulation und präzise pharmakologische Intervention, sondern pflegen synaptischen Organisation, die entscheidend für das Verständnis Synapse Funktion in einem naturalistischen Kontext als Routine-Kultur dissoziierten Neuronen Methoden ist.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Vorbereitung und Kultur Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden können. Diese Methode ermöglicht den einfachen Zugriff auf die Scheiben zur genetischen Manipulation mit unterschiedlichen Ansätzen, wie virale Infektionen oder 5,6 Biolistik 7. Darüber hinaus können Scheiben leicht für biochemische Assays 8 gewonnen werden, oder an Mikroskopen für die Bildgebung 9 oder elektrophysiologischen Experimenten 10.

Protocol

1. Vor dem Start der Vorbereitung von Schnitten des Hippocampus. Bereiten Sie das Gewebe Allesschneider, indem ein Stück Teflon Blatt und Montage einer neuen Klinge. Wischen Sie die Gewebekultur (TC) Kapuze mit 70% Ethanol und stellen Sie die Präpariermikroskop innen. Sterilisieren der Haube, Mikroskop, Gewebe Hobel und alle Sezierbesteck für 15 Minuten mit UV-Licht. Bereiten Sie sechs gut TC-Platten. Add 750 ul Stück Kultur Medien (SCM) pro Vertiefung und Ort Zellkultureinsätzen in j…

Discussion

Diese Methode basiert auf der Methode zuerst von Stoppini et al beschrieben ist. 11 und bietet eine schnelle Art und Weise zur Kultur Schnitten des Hippocampus. Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls ist die Erhaltung Scheiben steril, daher ist es wichtig, geeignete sterile Techniken zu verwenden und richtig zu desinfizieren und sterilisieren das gesamte Material in Kontakt mit dem Gewebe.

Verschiedene Seren Quellen können Einfluss auf die Qualität der Scheibe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von NINDS finanziert – NIH R01NS060756

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cell culture inserts   Millipore PICM03050  
6 well plates   BD Falcon 353046  
Tissue Slicer   Stoelting 51425/51415  
Microscope   Olympus SZX7-ILLD2-100  
Hippocampus dissecting tool   F.S.T 10099-15  
Large utility scissors. Perfection   F.S.T 37500-00/37000-00 Right/ Left handed  
Iris Spatula   F.S.T 10093-13  
Straight spatula   F.S.T 10094-13  
Rounded spoon micro spatula   VWR 57949-039  
Dissecting single cutting edge needle   Electron Microscopy Science 72946  
Dissecting tweezers   Dummont #2  
Small dissecting scissors   F.S.T 14060-10  
MEM Eagle medium   Cellgro 50-019 PB  
Horse serum heat inactivated   Invitrogen 26050-88  
L-Glutamine (200 mM)   Invitrogen 25030081  
CaCl2 (1 M)   Sigma C3881  
MgSO4 (1 M)   Sigma M2773  
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N   Sigma I0516  
Ascorbic Acid, solution (25%)   Sigma A4544  
D-Glucose   Sigma G5767  
NaHCO3   Sigma S6014  
Hepes   Sigma H7523  
Sucrose   Sigma S5016  
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS   Sigma P0290  
KCl   Sigma P3911  
MgCl2 (1 M)   Sigma M9272  

References

  1. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
  2. Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. n. t. r. o. d. u. c. t. i. o. n. Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
  3. Shepherd, G. M. . The synaptic organization of the brain. , (2004).
  4. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  5. Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  6. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
  7. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  8. Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
  9. Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
  10. Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  12. Simoni, A. D. e., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).

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Cite This Article
Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2462, doi:10.3791/2462 (2011).

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