Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס
Summary
אנו מתארים שיטה להכין פרוסות בהיפוקמפוס organotypic כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. פרוסות המוח מוטלות על ממברנות נקבוביים התקשורת בתרבות מותר להקים ממשק. שיטה זו משמרת את הארכיטקטורה ברוטו של ההיפוקמפוס עד 2 שבועות בתרבות.
Abstract
ההיפוקמפוס, רכיב של המערכת הלימבית, משחק תפקידים חשובים בזיכרון לטווח ארוך וניווט מרחבי 1. נוירונים בהיפוקמפוס יכול לשנות את עוצמת הקשרים שלהם לאחר תקופות קצרות של הפעלה חזקה. תופעה זו, הידועה בשם potentiation לטווח ארוך (LTP) יכולה להימשך שעות או ימים הפך את המנגנון המועמד הטוב ביותר למידה וזיכרון 2. בנוסף, אנטומיה מוגדר היטב וקישוריות של ההיפוקמפוס 3 הפכה אותה מערכת מודל קלאסי ללמוד הילוכים הסינפטי ו 4 הפלסטיות הסינפטית.
כפי הבנתנו את הפיזיולוגיה של סינפסות בהיפוקמפוס גדל שחקנים מולקולריים הפך מזוהה, צורך לתמרן חלבונים סינפטיים הכרח. תרבויות בהיפוקמפוס Organotypic להציע את האפשרות למניפולציות הגן קל התערבות פרמקולוגית מדויק אבל לשמור על ארגון הסינפטי הוא קריטי להבנת תפקוד הסינפסה בהקשר נטורליסטי יותר בתרבות שיטות שגרתיות נוירונים ניתק.
כאן אנו מציגים שיטה להכין ותרבות פרוסות בהיפוקמפוס, כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. שיטה זו מאפשרת גישה קלה את פרוסות עבור מניפולציה גנטית באמצעות גישות שונות כמו זיהום ויראלי או 5,6 biolistics 7. בנוסף, פרוסות ניתן לשחזר בקלות עבור מבחני ביוכימיים 8, או להעביר מיקרוסקופים הדמיה 9 או בניסויים אלקטרו 10.
Protocol
Discussion
שיטה זו מבוססת על השיטה שתוארה לראשונה על ידי Stoppini et al. 11 ומציע בצורה מהירה פרוסות תרבות בהיפוקמפוס. ההיבט החשוב ביותר של פרוטוקול זה היא לשמור על פרוסות סטרילי ולכן זה קריטי להשתמש בטכניקות סטרילי המתאים כראוי לחיטוי לעקר את כל החומר במגע עם רקמות.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NINDS – NIH R01NS060756
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
| 6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
| Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
| Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
| Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
| Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
| Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
| Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
| CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
| MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
| D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
| Hepes | Sigma | H7523 | ||
| Sucrose | Sigma | S5016 | ||
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
| KCl | Sigma | P3911 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. n. t. r. o. d. u. c. t. i. o. n. Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. . The synaptic organization of the brain. , (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
