Analysera funktion Små GTPases genom mikroinjektion av plasmider till Polarized epitelceller

Summary

Den här artikeln detaljer förfarandet i samband överuttryck och analys av små GTPases i polariserade epitelceller med mikroinjektion teknik.

Abstract

Epitelceller polarisera sina plasmamembranet i biokemiskt och funktionellt olika apikala och basolateral domäner där apikala domän står det "fria" ytor och basolateral membranet är i kontakt med underlaget och angränsande celler. Båda membran domäner är åtskilda av tight junctions, som utgör en diffusionsspärr. Apikala-basolateral polarisering kan rekapituleras framgångsrikt i kultur när epitelceller som Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler är seedade i hög densitet på polykarbonat filter och odlade i flera dagar ^{1 2.} Upprättande och underhåll av cellens polaritet regleras av en rad små GTPases av Ras superfamiljen som Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 och Rab13 ^{3 4 5 6 7.} Liksom alla GTPases dessa proteiner växla mellan en inaktiv BNP-bundet tillstånd och ett aktivt GTP-bundet tillstånd. Specifika mutationer i nukleotid bindande regionerna störa denna cykel ^8. Till exempel är Rab13T22N permanent låst i BNP-form och därför kallas "dominerande negativ", medan Rab13Q67L inte längre kan hydrolysera GTP och är därmed låst i ett "dominerande aktiva" status ^7. Att analysera deras funktion i celler både dominerande negativa och dominerande aktiva alleler av GTPases normalt uttrycks på höga nivåer för att störa funktionen av kroppsegna proteiner ^9. Ett elegant sätt att uppnå en hög nivå av överuttryck i en kort tid är att införa de plasmider som kodar för relevanta proteiner direkt i kärnan av polariserade celler som odlas på filtret stöder med mikroinjektion teknik. Detta kombineras ofta med samtidig injektion av reporter plasmider som kodar för receptorer plasmamembranet som är specifikt sorteras till apikala eller basolateral domän. En last som används ofta för att analysera last sortering till basolateral domänen är en temperaturkänslig varianten av vesikulär stomatit virus glykoprotein (VSVGts045) ^10. Detta protein kan inte lägga sig ordentligt vid 39 ° C och blir därmed kvar i endoplasmatiska retiklet (ER), medan det föreskrivande proteinet av intresse är monterade i cytosolen. En övergång till 31 ° C att sedan låta VSVGts045 att lägga på rätt sätt, lämna ER och resa till plasmamembranet ^11. Denna jakt är vanligtvis utförs i närvaro av cykloheximid för att förhindra ytterligare proteinsyntesen vilket leder till renare resultat. Här beskriver vi i detalj förfarandet för microinjecting plasmider till polariserade celler och efterföljande inkubationer inklusive temperatur förändringar som gör en omfattande analys av reglerande proteiner involverade i basolateral sortering.

Protocol

1. Isolering av Plasmid DNA

1. Använd ett Sigma-Aldrich endotoxin-fri maxiprep kit för att förbereda endotoxin gratis DNA enligt tillverkarens protokollet. Detta kit fungerar för oss, eftersom det säkert tar bort alla endotoxiner från DNA förberedelser. Endotoxiner som injiceras med DNA i cellkärnan kommer att leda till celldöd.
2. Tillsätt 100 l fenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) till isolerade DNA, virvel och snurra i 1 min vid 13 tusen varv i ett Eppendorf mikrocentrifug. Överför den övre vattenfasen i ett nytt rör och tillsätt 100 l kloroform / isoamylalcohol (24:1), virvel och snurra som ovan. Överför den övre vattenfasen innehållande DNA till ett nytt rör. Detta steg behövs för att ta bort protein från DNA, vilket förhindrar igensättning av mikroinjektion nålen.
3. Fällning DNA genom att lägga till Na Acetate (pH 6,0) till en slutlig koncentration av 300 mm och 2 X vol 100% etanol. Inkubera vid -20 ° C över natten. Spin-DNA i 20 min vid 13.000 rpm i ett Eppendorf mikrocentrifug, tvätta en gång med 70% etanol, och återsuspendera i 300 l endotoxin-fritt vatten (Sigma-Aldrich).
4. Bestäm DNA-koncentration. En typisk DNA-koncentration varierar från 1 till 5 mikrogram / l.

2. Kultur av MDCK celler

1. Dela MDCK celler. Räkna celler och utsäde 4 x 10 ⁵ celler på tydliga 12-mm Transwell filter (0,4 ìm porstorlek, Corning Costar, 3460). För ett experiment med en modell injektion kontroll och två olika muterade proteiner Rab du behöver frö tre filter.
2. Kultur MDCK celler i MEM medium med 2 mM L-glutamin, 0,1 mg / ml penicillin / streptomycin och 7% (vol / vol) fetalt bovinserum (= MEM tillväxt medier) vid 37 ° C och 5% CO _2.
3. Ändra media i basolateral kammaren varje dag. Detta hjälpmedel polariseringen processen, eftersom det härmar situation epitelceller hos djur.
4. 2 dagar efter sådd kolla i mikroskop om cellerna växer i en sluten monolager. Om du inte kan upptäcka eventuella hål i cellslager, utföra experimentet på dag 3. Om det fortfarande finns hål, utföra experimentet på dag 4.

3. Mikroinjektion arbetsordningen och efter injektion inkubationer

1. På dagen av försöket att förbereda 5 ml medier MEM tillväxt plus 50 mM HEPES i en 60 x 15 mm plåt för varje filter och placera in i ett 39 ° C inkubator. Dessutom inrättas en brunn på en 12-brunnar med 1 ml MEM tillväxt Media Plus 50 mM HEPES och 0,1 mg / ml cykloheximid per filter, och placera in i ett 31 ° C inkubator.
2. Slå på mikroinjektion mikroskop och sätta sin uppvärmda steg till 39 ° C. Vi använder ett inverterat mikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss mikrovisualisering, Inc.) med en uppvärmd skede, 10X och 32X mål och en Eppendorf Femtojet (Injectman NI2). Slutligen öppnar tanken kvävgas som förser luften bordet med kväve.
3. Späd DNA med filtrerat vatten (använd 0,2 ìm filtret) till en slutlig koncentration av 0,2 mg / ml i en total volym på 10 till 100 l. Därefter spin-DNA i Eppendorf mikrocentrifug vid 13.000 rpm i 30 min. Ta bort övre delen och placera den i ett nytt rör. Det här steget försäkrar att när du laddar din utspädd DNA i mikroinjektion nål du exakt kan ladda "ren" DNA. Din DNA är nu klar för mikroinjektion.
4. Förbered dina celler genom att ta det första filtret ur dess kultur maträtt. Med ett kirurgiskt blad (Feather Kirurgiska Blade, rostfritt stål, nr 11), skär ut filtret från filterhållaren och placera i 5 ml, 39 ° C varmt MEM odlingssubstrat plus 50 mM HEPES (60 x 15 mm plåt). Väg ner filtret i kulturen plattan med kirurgiska blad du använde för att skära ut det. Placera den på filtret så att hålet på kirurgiska bladet omger mitten av filtret. Placera din odlingsplatta på uppvärmda skede av mikroskop.
5. Belastning 2-3 l av din utspädd DNA (i detta fall plasmider kodning VSVGts045-GFP = hånar injektion kontroll) i en mikroinjektion nål (Femtotip II, Eppendorf, 930.000.043), vrid skyddande hölje av nålen och låt den falla till golvet . Nu nålen är redo att skruvas fast i hållaren. För att göra detta trycker du på menyknappen på din injectman och se till att ventilen stängs. Skruva fast nålen i hållaren, akta att inte skruva in nålen för hårt eftersom det kan leda till brott. Nu trycker du på menyknappen igen, kommer den tillämpade p _C hindra media från att sugas in nålen under microinjeciton förfarandet. Slutligen trycker du på din joystick för att radera lagrade homing.
6. För att sänka nålen på cellerna använder 10X mål och sätta nålen i ljusstrålen ovanför vätskan. Nu fokusera på cellerna, ta fokus igen genom att vrida fokus hjulet 180 ° uppåt, och hitta nålen. Därefter långsamt flytta nålen i fokus, sedan ta ur fokus igen (arbeta för att få cellerna i fokus igen), få ​​ner nålen i förkunder igen. Upprepa tills kanylen når ytan av media, då allt du kommer att se är en gloria. När du når en punkt där cellerna är i fokus, men nålen är fortfarande luddiga (dvs. ur fokalplanet) byta till 32X objektiv och fina grova inställningar.
7. Ställ in z-gräns genom att trycka på apikala membran med spetsen på nålen och dra ifrån ca 10 mikrometer eftersom kärnorna är om ca 10 mikrometer under apikala membranet.
8. När du har angett z-gräns, hitta rätt insprutningstryck. Start kl 95 PSI. Om trycket är för högt, kommer dina celler spränga. Om du är för lågt, kommer du att se en vit prick som stannar, men inget annat händer. Med en lyckad injektion, kommer du att se en fas ändras utan en cellstorlek förändring. För injektion, ta ut nålen ett par mikrometer ur fokalplanet så fort som möjligt. Syftet med nålen över kärnan (dvs mitt i en enskild cell) och tryck på injektionsknappen på din joystick, men inte håller knappen nere.
9. Injicera 100-500 celler i hål på din kirurgisk kniv som ligger på dina celler. När du är klar, placera dina celler med kulturen skålen och kirurgiska bladet i en 39 ° C inkubator, och inkubera i 2 h. Under denna tid är VSVGts045-GFP uttrycks och utsöndras i ER. Men vid 39 ° C, kan VSVGts045-GFP gånger inte korrekt och kan därför inte lämna ER. Under tiden kommer de små GTPase intresse ansamlas i cytosolen i samarbete injektion experiment.
10. Efter 2 h, placera dina celler i 1 ml MEM tillväxt Media Plus 50 mM HEPES och 0,1 mg / ml cykloheximid i en 12-brunnar och inkubera i 2 timmar vid 31 ° C. Under denna jakt period kommer VSVGts045-GFP gånger korrekt, lämnar ER och levereras till cellytan.
11. Upprepa steg från 3,1 till 3,10 för filter två (injicera plasmider kodning VSVGts045-GFP och exempelvis V5-märkta Rab13T22N) och tre (injicera plasmider kodning VSVGts045-GFP och exempelvis V5-märkta Rab13Q67L). Varje injektion kommer att ta ca 20 - 60 min. Men det är absolut nödvändigt att behandla varje filter på samma sätt i hela inkubationer temperatur skift och yta färgning tills du fixera cellerna. Efter fixering kan du göra resten av ditt färgningsprotokollet för alla filter på samma gång.

4. Yta Färgning för Immunofluorescens analys

Obs, för att undvika blekning av GFP signal VSVGts045-GFP, skydda exemplar från ljuset genom att täcka med aluminiumfolie under alla efterföljande förfaranden.

1. Om du vill utföra ytan färgning, placera dina celler i en kultur maträtt på en metallplatta på is och tvätta dina celler 1X med iskallt PBS ^{2 +} (PBS [0,2 g / l KCl, 0,2 g / liter KH ₂ PO _4, 8 g / liter NaCl och 2,17 g / l Na ₂ HPO ₄ x 7 H ₂ O] plus 0,1 g / liter CaCl ₂ och 0,1 g / liter MgCl ₂ x 6 H ₂ O). Därefter plats 30 ìl av en antikropp som känner igen ectodomain av protein, i detta fall den monoklonala antikroppen TK1 (IgG _1, från slutet av Thomas Kreis), på ren parafilm placeras på metallplattan på is. Placera filtret med dina celler upp och ner på drop och tillsätt några droppar av antikropp på baksidan av filtret. Inkubera i 1 timme på is.
2. Placera celler i ett 12-brunnar, tvätta 3X med iskallt PBS ^{2 +} (eller RT varmt PBS ^{2 +} utan föregående ytan färgning) och fixa med 3% paraformaldehyd i 15 min vid RT.
3. Tvätta cellerna en gång med PBS ^{2 +} och lämna i PBS ^{2 +} i 5 min.
4. Inkubera cellerna i en blockerande / permeabilization buffert (BPB) (2% [WT / VOL] BSA, 0,4% [WT / VOL] saponin i PBS ^{2 +)} med 10% [vol / vol] get serum. Inkubera 1 timme vid RT.
5. Späd primära antikroppar för att detektera uttryckt Rab GTPase, i detta exempel anti-V5 (mus monoklonal antikropp IgG _2a, Invitrogen), 1:200 i BPB. Spin utspädd antikroppar i ett Eppendorf mikrocentrifug i 10 min vid 13.000 rpm. Placera 30 l av antikroppen lösningen på rena parafilm placeras i en fuktig kammare. Placera celler på filtret upp och ner på antikroppen droppe och inkubera i 1 timme vid RT.
6. Placera cellerna tillbaka (höger sida upp) i en 12-brunnar och tvätta 5X över 30 min med BPB vid RT.
7. Späd lämpliga sekundära antikroppar, i det här fallet get-anti-mus-IgG ₁ Alexa 594-märkt (för VSVG upptäckt på ytan, Invitrogen) och Cy5 märkta sekundära antikroppar att känna igen din Rab GTPase, i detta exempel get anti-mus IgG _2a Cy5-märkta (Jackson ImmunoResearch), 1:200 till BPB och snurra som ovan. Placera 30 l antikropp lösning på ren parafilm i en fuktig kammare och celler plats på filtret upp och ner på antikroppar droppe. Inkubera 1 timme vid RT.
8. Upprepa steg 4,6.
9. Doppa celler på filtret 3X i avjoniserat vatten och placera right sidan upp på microslides. Tillsätt 10-15 l montera (10% [WT / VOL] DABCO, 50% [WT / VOL] glycerol i destillerat vatten) på toppen av cellerna. Placera 18X18 mm mikro skyddsglas på ovansidan och använda ansiktsservetter tryck försiktigt mikro täckglaset på cellerna. Tätning med nagellack.
10. Analysera prover med en konfokalmikroskop. Vi använde en Microsystem LSM 510, Carl Zeiss mikrovisualisering, Inc. som var utrustad med en 63x nedsänkning i vatten lins.
11. För beredning av siffror, anpassa och kombinera bilder med hjälp av program som Adobe Photoshop och Adobe Illustrator.

5. Representativa resultat

För exempel på hur co-uttryck för små GTPases stör VSVG sortering vänligen hänvisa till publicerade artiklar för antingen apikala missorting ^{3, 4} eller hämning av yta leverans ^7.

Figur 1. I mock-injektion, dvs en injektion av enbart plasmiden kodning VSVGts045-GFP är ett protein levereras till basolateral ytan av väl polariserad MDCK celler som bedöms av ytan färgning (i rött, Figur 1 A). Observera att inte alla VSVGts045-GFP levereras till basolateral membranet under jakten vid 31 ° C, vilket framgår av den omfattande intracellulära signalen för den totala protein (i grönt, figur 1 A och B). I celler som inte är väl polariserad VSVGts045-GFP kommer att levereras också till apikala membran (Figur 1 B). Om din kontroll exemplar ser ut i cellen i figur 1 B, kan du lita inte dina uppgifter och måste upprepa experimentet med bättre polariserade celler. Skala barer är 5 ìm.

Discussion

Den mest kritiska stegen för en lyckad mikroinjektion experiment är kvalitet och renhet av DNA och polariteten av dina celler. Utan polariserade celler, kommer din injektion kontroll redan har mistargeted VSVG och experimentet kan inte användas. Om DNA är av dålig kvalitet, kan DNA täppa injektionsnålen som leder till dålig eller ingen uttryck av det önskade proteinet alls. Dessutom är det tillrådligt att använda uttrycket plasmider som är kända för att leda till höga uttryck nivåer som pRKV.

Om du vill testa för sortering av annan last proteiner kan temperaturen skift protokollen ändras. Till exempel, för att uttrycka LDL-receptorer, utför vi mikroinjektion vid 37 ° C följt av en 1 h inkubation vid 37 ° C, 4 timmar vid 20 ° C (för att arrestera lasten i TGN) och 2 timmar vid 37 ° C i närvaro av 0,1 mg / ml cykloheximid att jaga protein till ytan. För vissa proteiner såsom Fc-receptorer, ° inkubationstiden vid 20 C kan sänkas till 2 timmar beroende på hur snabbt din last protein syntetiseras och färdas genom Utsöndringsvägarna. För en detaljerad beskrivning av inkubationer att vi används för olika last proteiner se Nokes et al. 2008 ^7.

Slutligen kan detta protokoll inte bara användas för analys av små GTPases, men i teorin för alla proteiner eller fragment protein som du misstänker kan ha en funktion i (polariserade) yta leverans.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400