Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verfahren in Überexpression und Analyse von kleinen GTPasen in polarisierten Epithelzellen mit Mikroinjektionstechnik beteiligt.
Abstract
Epithelzellen polarisieren ihrer Plasmamembran in biochemisch und funktionell unterschiedliche apikalen und basolateralen Bereichen, in denen die apikale Domäne Gesichter der "freien" Flächen und der basolateralen Membran in Kontakt mit dem Substrat und den benachbarten Zellen. Sowohl Membran-Domänen sind durch Tight Junctions, die eine Diffusionsbarriere Form getrennt. Apical-basolateralen Polarisation kann erfolgreich in Kultur rekapituliert werden, wenn Epithelzellen wie Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen in hoher Dichte auf Polycarbonat-Filtern ausgesät und kultiviert für mehrere Tage 1 2. Aufbau und Pflege von Zellpolarität ist durch eine Reihe von kleinen GTPasen der Ras-Superfamilie wie Rala, Cdc42, Rab8, RAB10 und Rab13 3 4 5 6 7 geregelt. Wie alle GTPasen diese Proteine Zyklus zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen Zustand und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand. Spezifische Mutationen in der Nukleotid-bindenden Regionen stören mit diesem Rad 8. Zum Beispiel ist Rab13T22N dauerhaft in der GDP-Form gesperrt und damit Beinamen "dominant negative", während Rab13Q67L nicht mehr hydrolysieren können GTP und ist somit in eine "beherrschende active 'Zustand 7 gesperrt. Zur Analyse ihrer Funktion in Zellen sowohl dominant negative und dominant aktiven Allele GTPasen sind in der Regel auf einem hohen Niveau zum Ausdruck gebracht, mit der Funktion der körpereigenen Proteinen 9 eingreifen. Eine elegante Methode zur hohen Überexpression in kürzester Zeit zu erreichen, ist die Plasmide der entsprechenden Proteine direkt in den Kernen der polarisierten Zellen auf Filterpapier unterstützt die Verwendung von Mikroinjektionstechnik gewachsen einzuführen. Dies ist oft mit dem Co-Injektion von Reporter-Plasmide, die Plasmamembran-Rezeptoren, die speziell auf die apikalen oder basolateralen Domäne sortiert kodieren kombiniert. Eine Ladung häufig verwendet, um Fracht zu analysieren Sortierung der basolateralen Domäne ist eine temperaturempfindliche Allel des vesikulären Stomatitis Virus Glycoprotein (VSVGts045) 10. Dieses Protein kann nicht richtig falten bei 39 ° C und wird somit in das endoplasmatische Retikulum (ER) zurückgehalten werden, während das regulatorische Protein von Interesse im Cytosol zusammengebaut wird. Eine Verschiebung um 31 ° C lassen sich dann VSVGts045 richtig falten, verlassen das ER und Reisen in die Plasmamembran 11. Diese Jagd ist in der Regel in Gegenwart von Cycloheximid durchgeführt, um weitere Proteinsynthese, was zu saubereren Ergebnisse zu verhindern. Hier haben wir im Detail beschreiben das Verfahren der Mikroinjektion Plasmide in polarisierten Zellen und anschließender Inkubation wie Temperatur verschiebt sich, dass eine umfassende Analyse von regulatorischen Proteinen in basolateralen Sortierung beteiligt zu ermöglichen.
Protocol
Discussion
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Mikroinjektion Experiments sind die Qualität und Reinheit der DNA und die Polarität der Zellen. Ohne polarisierten Zellen, wird die Injektion Kontrolle bereits VSVG mistargeted haben und das Experiment kann nicht verwendet werden. Wenn die DNA ist von schlechter Qualität, kann die DNA verstopfen die Injektionsnadel, die zu schlechte oder gar keine Expression des gewünschten Proteins an alle. Auch ist es ratsam, Expressionsplasmide, die bekanntermaßen eine hohe Express…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM070736) zu H. Fölsch finanziert. SF Ang wurde von einem A * STAR Graduate Scholarship Award unterstützt, und RS Kang wurde von der Cellular and Molecular Basis of Disease Training Program (GM8061) unterstützt
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Mellman, I., Nelson, W. J. . Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. . Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
- Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. . The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
- Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. . Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
- Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. . Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
- Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. . Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).
- Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. . The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).
- Collins, R. N. Molecular cell. 12, 1064-1064 (2003).
- Hall, A. . Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).
- Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. . Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).
- Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. . Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).
