El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas
Summary
Este artículo detalla los procedimientos involucrados en la sobreexpresión y el análisis de las pequeñas GTPasas en células epiteliales polarizadas utilizando la técnica de microinyección.
Abstract
Las células epiteliales polarizar su membrana plasmática en los dominios apical y basolateral de vista bioquímico y funcionalmente diferentes, donde el dominio apical se enfrenta a la 'libre' y las superficies de la membrana basolateral está en contacto con el sustrato y las células vecinas. Ambos dominios de la membrana están separados por uniones estrechas, que forman una barrera de difusión. Apical-basolateral polarización se pueden recapitular con éxito en el cultivo cuando las células epiteliales como el riñón canino Madin-Darby (MDCK) se siembran a alta densidad en los filtros de policarbonato y se cultivan durante varios días 1 2. Establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular está regulado por una serie de pequeñas GTPasas de la superfamilia Ras como Rala, Cdc42, Tab8, Rab10 y Rab13 3 4 5 6 7. Al igual que todas las GTPasas estas proteínas del ciclo entre una inactivos PIB determinada del Estado y un Estado activo GTP. Mutaciones específicas en las regiones de unión de nucleótidos interferir con este ciclo de 8. Por ejemplo, Rab13T22N está permanentemente encerrado en el PIB de forma y por lo tanto llamado "dominante negativo", mientras que Rab13Q67L ya no pueden hidrolizar GTP y por lo tanto encerrado en una "dominante activo" del Estado 7. Para analizar su función en las células de los dos alelos dominantes negativos activa y dominante de GTPasas se suelen expresar en niveles altos para interferir con la función de las proteínas endógenas 9. Una manera elegante de alcanzar altos niveles de sobre-expresión en un corto período de tiempo es la introducción de los plásmidos que codifican las proteínas relevantes directamente en los núcleos de las células polarizadas crecido en el filtro admite el uso de la técnica de microinyección. Esto se combina a menudo con la co-inyección de reportero plásmidos que codifican los receptores de la membrana plasmática que están específicamente ordenados en el dominio apical o basolateral. Una carga usados para analizar la carga de clasificación para el dominio basolateral es un alelo sensible a la temperatura de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVGts045) 10. Esta proteína no se pueden plegar correctamente a 39 ° C y por lo tanto se mantendrá en el retículo endoplasmático (ER), mientras que la proteína reguladora de interés se monta en el citosol. Un cambio a 31 ° C, entonces permitirá que VSVGts045 a veces bien, salir de la sala de emergencia y los viajes a la membrana plasmática 11. Esta persecución se realiza generalmente en presencia de cicloheximida para prevenir la síntesis de proteínas mayor que conduce a resultados más limpios. A continuación se describe en detalle el procedimiento de la microinyección de plásmidos en células polarizadas y incubaciones posteriores incluyendo los cambios de temperatura que permiten un análisis completo de las proteínas reguladoras implicadas en la clasificación basolateral.
Protocol
Discussion
Los pasos más importantes para un experimento de microinyección éxito son la calidad y pureza del ADN y la polaridad de las células. Sin células polarizadas, el control de la inyección ya se han mistargeted VSVG y el experimento no se puede utilizar. Si el ADN es de mala calidad, el ADN puede obstruir la aguja de inyección que lleva a los pobres o no la expresión de la proteína deseada en absoluto. Además, es aconsejable usar plásmidos de expresión que se sabe que conducen a altos niveles de expresión como …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (GM070736) a H. Fölsch. SF Ang fue apoyado por una beca A * Star de Postgrado, y RS Kang recibió el apoyo de las bases celulares y moleculares de la enfermedad de Programa de Formación (GM8061)
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
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