Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen
Summary
Dit artikel beschrijft de procedures met betrekking tot overexpressie en analyse van kleine GTPases in gepolariseerd epitheliale cellen met behulp van micro-injectie techniek.
Abstract
Epitheliale cellen polariseren hun plasmamembraan in biochemisch en functioneel verschillende apicale en basolaterale domeinen waar de apicale domeinnaam wordt geconfronteerd met de 'vrije' oppervlakken en de basolaterale membraan is in contact met de ondergrond en de naburige cellen. Beide membraan domeinen zijn van elkaar gescheiden door tight junctions, die een diffusie barrière vormen. Apicale-basolaterale polarisatie met succes kunnen worden samengevat in de cultuur als epitheliale cellen zoals Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen worden gezaaid met een hoge dichtheid op polycarbonaat filters en gekweekt gedurende enkele dagen een twee. Opzetten en onderhouden van celpolariteit wordt geregeld door een reeks van kleine GTPases van de Ras superfamilie, zoals Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 en Rab13 3 4 5 6 7. Net als alle GTPases deze eiwitten cyclus tussen een inactieve GDP-gebonden toestand en een actieve GTP-gebonden toestand. Specifieke mutaties in de nucleotide binding regio's interfereren met deze fiets 8. Bijvoorbeeld, is Rab13T22N permanent opgesloten in het BBP-vorm en dus noemde 'dominant negatief', terwijl Rab13Q67L niet meer kan hydrolyseren GTP en is dus opgesloten in een staat 'dominante actief' 7. Voor het analyseren van hun functie in de cellen zowel dominant negatief en dominant actieve allelen van GTPases zijn meestal uitgedrukt in hoge mate te bemoeien met de functie van de endogene eiwitten 9. Een elegante manier om een hoog niveau van overexpressie in een korte tijd te bereiken is de invoering van de plasmiden die coderen voor de relevante eiwitten direct in de kernen van gepolariseerde cellen gekweekt op filter ondersteunt het gebruik van micro-injectie techniek. Dit wordt vaak gecombineerd met de co-injectie van de reporter-plasmiden die plasma membraan receptoren die specifiek zijn gesorteerd naar de apicale of basolaterale domeinnaam coderen. Een lading vaak gebruikt om lading te analyseren sorteren aan de basolaterale domein is een temperatuur gevoelig allel van de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSVGts045) 10. Dit eiwit kan niet goed voudig bij 39 ° C en zal dus worden bewaard in het endoplasmatisch reticulum (ER), terwijl de regulerende eiwit van belang is gemonteerd in de cytosol. Een verschuiving naar 31 ° C zal dan de mogelijkheid VSVGts045 goed te vouwen, laat de ER en reizen naar de plasmamembraan 11. Dit jacht is meestal uitgevoerd in de aanwezigheid van cycloheximide om verdere eiwitsynthese die leidt tot schoner resultaten te voorkomen. Hier beschrijven we in detail de procedure van microinjecting plasmiden in gepolariseerde cellen en de daaropvolgende incubaties inclusief temperatuur verschuivingen die een uitvoerige analyse van regulerende eiwitten die betrokken zijn bij basolaterale sorteren mogelijk te maken.
Protocol
Discussion
De belangrijkste stappen voor een succesvolle micro-injectie experiment zijn de kwaliteit en de zuiverheid van het DNA en de polariteit van je cellen. Zonder gepolariseerde cellen, zal de injectie controle al mistargeted VSVG en het experiment kan niet worden gebruikt. Als het DNA is van slechte kwaliteit, kan het DNA verstoppen de injectienaald die leidt tot slechte of geen expressie van het gewenste eiwit helemaal. Ook is het raadzaam om expressieplasmiden waarvan bekend is dat leiden tot hoge expressie niveaus, zoals…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Institutes of Health (GM070736) naar H. Fölsch. SF Ang werd ondersteund door een A * STAR Graduate Scholarship Award, en RS Kang werd ondersteund door de cellulaire en moleculaire basis van Disease Training Program (GM8061)
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Mellman, I., Nelson, W. J. . Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. . Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
- Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. . The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
- Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. . Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
- Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. . Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
- Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. . Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).
- Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. . The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).
- Collins, R. N. Molecular cell. 12, 1064-1064 (2003).
- Hall, A. . Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).
- Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. . Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).
- Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. . Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).
