ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב
Summary
מאמר זה מפרט את ההליכים הכרוכים overexpression וניתוח של GTPases קטן בתאי האפיתל מקוטב באמצעות טכניקה microinjection.
Abstract
תאים אפיתל לקטב הממברנה הפלסמטית שלהם לתוך תחומים apical ו basolateral ביוכימית וברור תפקודית שם תחום apical פניהם 'חינם' משטחים את הממברנה basolateral נמצא במגע עם המצע לבין תאים שכנים. שני תחומים מופרדים על ידי קרום צמתים הדוקים, המהווים מחסום דיפוזיה. Apical-basolateral קיטוב ניתן סיכם בהצלחה בתרבות כאשר לתאי האפיתל כגון כליה מדין-דארבי כלב (MDCK) התאים זורעים בצפיפות גבוהה על מסנני פוליקרבונט בתרבית במשך כמה ימים 1 2. הקמה ותחזוקה של הקוטביות בתא מוסדר על ידי מערך של GTPases קטן superfamily ראס כגון RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ו Rab13 3 4 5 6 7. כמו כל החלבונים האלה GTPases מחזור בין המדינה התמ"ג הנכנס פעילים מדינה פעיל GTP הנכנס. מוטציות ספציפיות באזורים מחייב נוקלאוטיד להפריע זה רכיבה על אופניים 8. לדוגמה, Rab13T22N נעול לצמיתות בצורה תוצר ועל כך לכינוי "דומיננטי שלילי", בעוד Rab13Q67L כבר לא יכול hydrolyze GTP ו נעול ולכן במצב "פעיל דומיננטי" 7. כדי לנתח את תפקידם בתאים אללים דומיננטי פעיל הן שליליות הדומיננטי של GTPases באים לידי ביטוי בדרך כלל ברמות גבוהות להפריע לתפקוד של חלבונים אנדוגניים 9. דרך אלגנטית להשיג רמות גבוהות של overexpression בסכום זמן קצר היא להציג את פלסמידים קידוד החלבונים הרלוונטיים ישירות לתוך הגרעינים של תאים בוגרים מקוטב על מסנן תומך באמצעות טכניקה microinjection. זה לעתים קרובות בשילוב עם הזרקת המשותפת של פלסמידים כתב המקודדים קולטנים הממברנה הפלסמטית כי ממוינות במיוחד לתחום apical או basolateral. המטען משמש לעתים קרובות כדי לנתח מטען מיון לתחום basolateral הוא אלל טמפרטורה רגיש של גליקופרוטאין וירוס שלפוחי stomatitis (VSVGts045) 10. חלבון זה לא יכול להתקפל כראוי על 39 מעלות צלזיוס, ובכך להישמר ב reticulum endoplasmic (ER), ואילו חלבון הרגולציה של הריבית התאספו cytosol. לעבור 31 מעלות צלזיוס לאחר מכן לאפשר VSVGts045 להתקפל כראוי, לעזוב את ER ולנסוע הממברנה פלזמה 11. מרדף זו מבוצעת בדרך כלל בנוכחות cycloheximide למנוע סינתזת חלבון נוספת מובילה לתוצאות הניקוי. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את ההליך של microinjecting פלסמידים לתאים מקוטב incubations העוקבים לרבות משמרות טמפרטורה המאפשרים ניתוח מקיף של חלבונים רגולטוריים המעורבים מיון basolateral.
Protocol
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר עבור ניסוי מוצלח microinjection הם איכות וטוהר של ה-DNA ואת הקוטביות של התאים שלך. ללא תאים מקוטב, שליטה זריקה שלך כבר mistargeted VSVG ואת הניסוי לא ניתן להשתמש. אם ה-DNA הוא באיכות ירודה, ה-DNA עשויה להדביק את מחט הזריקה המוביל עניים או כל ביטוי של החלבון הרצוי כלל. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM070736) ל ח Fölsch. SF אנג נתמכה על ידי בפרס STAR * מלגות לתארים מתקדמים, ו-RS קאנג נתמכה על ידי בסיס תאית ומולקולרית של תכנית אימונים מחלות (GM8061)
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Mellman, I., Nelson, W. J. . Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. . Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
- Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. . The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
- Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. . Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
- Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. . Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
- Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. . Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).
- Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. . The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).
- Collins, R. N. Molecular cell. 12, 1064-1064 (2003).
- Hall, A. . Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).
- Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. . Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).
- Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. . Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).
