Summary

Cultura organotípicas de Full-espessura Retina Porcina Adulto

Published: March 20, 2011
doi:

Summary

Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto por sete dias. Resumidamente, um papel estéril filtro foi utilizado para levantar a retina neural fora do RPE e do lado coloque fotorreceptoras em cima uma inserção levantadas por um carrinho feito por encomenda.

Abstract

Há uma demanda reconhecida por modelos in vitro que podem substituir ou reduzir a experimentação animal. Retina suína tem uma estrutura semelhante neuronal a retina humana e, portanto, uma espécie valiosa para estudar mecanismos de lesão da retina humana e doenças degenerativas. Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto isolado de olhos obtido a partir de um matadouro. Após a remoção do segmento anterior, uma lâmina de trépano foi usado para criar múltiplas retina neural-Bruch membrana-RPE-coróide esclera-explantes do segmento posterior de olhos de porco adulto. Um pedaço de papel filtro estéril foi utilizada para levantar a retina neural off de cada explante. O complexo de papel-filtro retina foi cultivado (lado fotorreceptor para cima) em cima de uma inserção, que foi realizada longe do fundo do prato de cultura por um carrinho feito por encomenda. O stand permite uma boa circulação do meio de cultura para ambos os lados da retina. Globalmente, este procedimento é simples, reprodutível e permite a preservação da estrutura da retina nativo para pelo menos sete dias, tornando-se um modelo útil para uma variedade de estudos morfológicos, farmacológicos e bioquímicos na retina de mamíferos.

Protocol

1. Fazendo uma posição custom-made para inserções de cultura de células A base de uma pipeta 5 ml ponta (ISC BioExpress, # P-3250-19) tem um diâmetro interno de 13 mm, o que combina perfeitamente com o tamanho inferior (12,6 mm, diâmetro externo) de um de 10 mm (diâmetro interno) de células NUNC inserir a cultura (8 mM, Policarbonato membrana, térmica, # 137443). Para fazer o suporte, a pipeta foi cortada perto da base para produzir de 6 mm longo cilindro oco. Então, as peças foram…

Discussion

Pesquisadores visão criaram uma variedade de sistemas de cultura da retina, incluindo sistemas de organotípicas, para estudar uma variedade de questões, tais como o transplante de células-tronco da retina 1, a regeneração da retina 2, e expressão de genes exógenos 3-5. No entanto, a retina de mamíferos adultos é difícil manter in vitro, principalmente devido à alta demanda de energia dos 6 fotorreceptores. Koizumi et al. Descrito um sistema de cul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder EY 012.031 (ET-A), um prêmio da Fundação FM Kirby (ET-A), para prevenir a cegueira Research, Inc. (MAZ), The New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ), O Instituto Eye of New Jersey (MAZ), o J. Joseph e Marguerite Retina DiSepio Research Fund (MAZ), eo Vassar e Janice Mitchell Mitchell Ashby Clube (AMK).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
MEM Invitrogen-Gibco 10370-021  
5 mL pipette tip ISC BioExpress P-3250-19  
NUNC cell culture insert Thermal 137443 8μm, Polycarbonate
Whatman 4M Filter paper Whatman 1004  
DMEM Cellgro-mediatech Inc 10-013-CV  
Agar Fluka 05040  
Fungizone Amphotericin B Invitrogen-Gibco 15290018  
Trephine blades Bausch and Lomb T3096 6.00mm
O.C.T. Compound Electron Microscopy Sciences 62550-01 4583
  Sciences    
Cryostat Leica CM1900  
Vibratome Leica Series 1000  
Confocal microscopy; Carl Zeiss LSM510  
Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody DSHB N/A  
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody DAKO DAKO  
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170  

References

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Cite This Article
Wang, J., Kolomeyer, A. M., Zarbin, M. A., Townes-Anderson, E. Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina. J. Vis. Exp. (49), e2655, doi:10.3791/2655 (2011).

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