Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming

Summary

Beschrijven we een nieuwe methode voor het verhogen van cDNA opbrengst van eencellige hoeveelheden mRNA in andere standaard laboratorium reverse transcriptie reacties. De nieuwigheid schuilt in het gebruik van een micromixer, die het fenomeen van akoestische microstreaming gebruikt om vloeistoffen mix op microliter schaal effectiever dan schudden, vortexen of fijnwrijving.

Abstract

Correleren genexpressie met cel gedrag is ideaal gedaan op de single-cell niveau. Dit is echter niet gemakkelijk te bereiken, omdat de kleine hoeveelheid labiele mRNA aanwezig is in een enkele cel (1-5% van de 1-50pg totaal RNA, of 0,01-2.5pg mRNA, per cel ¹⁾ meestal degradeert voordat het kan worden omgekeerd getranscribeerd in een stabiele cDNA kopie. Bijvoorbeeld met behulp van standaard laboratorium-reagentia en hardware, kan slechts een klein aantal genen kwalitatief worden beoordeeld per cel ^2. Een manier om de efficiëntie van standaard laboratorium reverse transcriptase (RT) reacties (dwz standaardtenders reagentia in microliter volumes), bestaande uit eencellige hoeveelheden mRNA te verhogen zou zijn om sneller meng de reagentia, zodat het mRNA kan worden omgezet naar cDNA voordat het breekt. Dit is echter niet triviaal omdat op microliter vloeistof schalen stroming laminair, dat wil zeggen op dit moment beschikbare methoden het mengen (dat wil zeggen schudden, vortexen en tritureren) onvoldoende chaotische beweging om effectief te mengen reagentia te produceren. Om dit probleem oplossen, micro-schaal mengen technieken worden gebruikt ^3,4. Een aantal van microfluïdische-based mixing technologieën zijn ontwikkeld die met succes te verhogen RT-reactie opbrengst ^5-8. Echter, microfluidics technologieën vereisen gespecialiseerde hardware die is relatief duur en nog niet algemeen beschikbaar. Een goedkoper, handiger oplossing is wenselijk. Het belangrijkste doel van deze studie is om aan te tonen hoe de toepassing van een roman "micromixing"-techniek met standaard laboratorium RT reacties bestaande uit eencellige hoeveelheden mRNA aanzienlijk hun cDNA opbrengst toeneemt. We vinden cDNA opbrengst te verhogen met ongeveer 10-100-voudig, die het mogelijk maakt: (1) een groter aantal genen te analyseren per cel, (2) meer kwantitatieve analyse van genexpressie, en (3) een betere detectie van lage-overvloed genen in enkele cellen. De micromixing is gebaseerd op akoestische microstreaming ^9-12, een fenomeen waarbij geluidsgolven verspreiden rond een klein obstakel maakt een gemiddelde stroming in de buurt van de hindernis. Hebben wij een akoestisch microstreaming-apparaat ("micromixer") met een belangrijke vereenvoudiging, akoestische microstreaming kan worden bereikt op audio-frequenties door te zorgen voor het systeem heeft een vloeistof-lucht-interface met een kleine kromtestraal ^13. De meniscus van een microliter volume van de oplossing in een buis biedt een voldoende kleine kromtestraal. Het gebruik van audio-frequenties betekent dat de hardware kan goedkoop en veelzijdig ^13, en nucleïnezuren en andere biochemische reagentia worden niet beschadigd als ze kunnen worden met standaard laboratorium sonicators.

Protocol

1. Micromixing een RT reactie Voordat u een RT-reactie met micromixing, evenwicht de micromixer op de gewenste temperatuur van de RT-reactie. Plaats de micromixer in een 37 ° C (of de temperatuur wordt aanbevolen door de leverancier RT) incubator gedurende tenminste 1 uur voor het begin van de RT-reactie. Stel de RT mix op basis van de reverse transcriptase leverancier (bijv. MMTV-RT van Promega, Omniscript van Qiagen) instructies, behalve gebruik maken van single-cell hoeveelhed…

Discussion

De wijze van toepassing van micromixing van standaard laboratorium RT reacties hier beschreven kan natuurlijk, betrekken mRNA geoogst via een methode (bijvoorbeeld cellysis, laser capture microdissectie). Het kan ook omvatten alle merken of types van RT reagentia, bij elke temperatuur (binnen de tolerantie van de materialen van de micromixer), en een periode van tijd. Zo hebben we vast beter cDNA opbrengsten van RT reacties bestaande uit willekeurig hexameer of oligo-dT primers. Het kan ook worden toegepast op andere bi…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices
PicoPure RNA Isolation Kit	Arcturus, CA, USA	KIT0204	The kit is now available from Applied Biosystems
DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents	Ambion	AM1906M
Random hexamer primers	Promega	C1181
AMV-RT	Promega	M5101
dNTP set	Promega	U1240
RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega	N2111
Nuclease-Free Water	Promega	P1193
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystem	4309155
Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotometer.	Thermo Scientific
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008