어쿠스틱 Microstreaming를 사용하여 표준 실험실 역방향 Transcriptase 반응에서 mRNA의 단일 세포로부터 cDNA 수량 산출 증가
Summary
우리는 달리 일반 실험실 역방향 전사 반응에서 mRNA의 단일 셀 수량로부터 cDNA 수율을 높이기 위해 새로운 방법을 설명합니다. 참신은 흔들림 vortexing 또는 분쇄보다 효과적으로 microliter 비늘에서 유체를 섞어, 음향 microstreaming의 현상을 활용 micromixer의 사용에 있습니다.
Abstract
세포의 행동과 연관 유전자 발현은 이상적으로 단일 세포 수준에서 이루어집니다. 그것이 베꼈는데를 반대하기 전에 하나의 셀 (1월 1일에서 5일까지 – 50pg 총 RNA의 % 또는 0.01 – 2.5pg mRNA, 셀 하나 당)에있는 불안 정한 mRNA의 작은 금액은 대부분이 저하하기 때문에 그러나, 이것은 쉽게 달성되지 않습니다 안정적인 cDNA 사본으로. 예를 들어, 표준 실험실 시약 및 하드웨어를 사용하여, 유전자의 단지 소수가 질적으로 전지 2마다 평가하실 수 있습니다. mRNA의 단일 셀 금액 구성된 표준 실험실 반전 transcriptase (RT) 반응 (microliter 볼륨에서 즉, 표준 시약)의 효율성을 높이는 한 가지 방법은 그것이 저하되기 전에 mRNA가 cDNA로 변환 수 있도록보다 신속하게 시약을 혼합하는 것입니다. 그러나 microliter 비늘에서 액체 흐름이 층류이기 때문에 이것은 하찮은되지 않습니다, 즉 혼합의 현재 방법 (흔들림 vortexing 및 분쇄 즉)은 효과적으로 시약을 혼합하는 데 충분한 혼란 움직임을 생산하기 위해 실패합니다. 이 문제를 해결하기 위해서, 마이크로 스케일 혼합 기법 3,4을 사용해야합니다. microfluidic 기반의 혼합 기술의 숫자가 성공적으로 RT 반응 수율에게 5-8를 증가하는 개발되었습니다. 그러나, microfluidics 기술은 상대적으로 비싸고 아직 널리 사용할 수없는 전문적인 하드웨어가 필요합니다. 저렴, 더 편리한 솔루션은 바람직합니다. 본 연구의 주요 목적은 mRNA의 단일 셀 수량 구성된 표준 실험실 RT 반응에 소설 "micromixing"기술의 응용은 크게 자신의 cDNA 수확량을 증가하는 방법을 보여줍니다하는 것입니다. 우리는 cDNA 산출이 가능하게 약 10 – 100 – 배로 증가 발견 (1) 세포마다 분석하는 유전자의 큰 숫자, 유전자 발현 (2) 더 많은 정량 분석하고, 낮은 풍부한 유전자 (3) 좋은 검출 단일 세포 인치 micromixing는 음향은 9-12 작은 장애물 주위에 전파 음파가 장애물 근처에 의미 흐름을 만드는 현상을 microstreaming을 기반으로합니다. 우리는 주요 단순화와 음향 microstreaming 기반 장치 (이하 "micromixer") 개발, 음향 microstreaming는 시스템이 굴곡 13 작은 반경을 가진 액체 공기 인터페이스를함으로써 오디오 주파수에서 얻을 수 있습니다. 튜브 솔루션 microliter 볼륨의 초승달 모양은 곡률 적절하게 작은 반경을 제공합니다. 오디오 주파수의 사용은 하드웨어가 저렴 13 다용도 수있다는 것을 의미하고 표준 연구소 sonicators 함께 할 수처럼 핵산 및 다른 생화 학적 시약이 손상되지 않습니다.
Protocol
Discussion
표준 실험실 RT 반응에 micromixing의 신청 방법은 물론, 참여 할 수 여기에 설명된 모든 방법 (예 : 세포 용해, 레이저 캡처 microdissection)을 통해 수확 mRNA. 그것은 또한 모든 브랜드 또는 형식 RT 시약의 어떤 온도 (micromixer의 재료의 허용 오차 이내), 시간의 기간을 구성하실 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 무작위로 hexamer 또는 oligo – DT primers로 구성된 RT 반응에서 개선 cDNA 수율을 관찰했습니다. 그것은 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (프로젝트 부여 안돼. 6,288,480)와 스코비와 클레어 맥키논 트러스트에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus, CA, USA | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega | C1181 | |
| AMV-RT | Promega | M5101 | |
| dNTP set | Promega | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Scientific | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
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