Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte
Summary
In questo rapporto si descrive un metodo per schiacciare nervo sciatico mouse. Questo metodo utilizza pinze emostatiche immediatamente disponibili e facilmente riproducibile e produce completo schiacciamento del nervo sciatico. Inoltre, si descrive un metodo per preparare supporti muscolo intero adatti per l'analisi di rigenerazione nervosa dopo schiacciamento del nervo sciatico.
Abstract
Rigenerazione del sistema nervoso periferico (SNP) è ampiamente studiata sia per la sua rilevanza per le malattie umane e comprendere la robusta risposta rigenerativa montato dai neuroni PNS così eventualmente illuminano i fallimenti di rigenerazione CNS 1. Schiacciamento del nervo sciatico (assonotmesi) è uno dei modelli più comuni di lesioni dei nervi periferici nei roditori 2. Frantumazione interrompe tutti gli assoni delle cellule di Schwann, ma lamine basali sono conservati in modo che la rigenerazione è ottimale 3,4. Ciò consente al ricercatore di studiare proprio la capacità di un assone di interagire sia con il cellule di Schwann e lamine basale 4. I ratti sono stati generalmente i modelli animali preferiti per schiacciamento del nervo sperimentale. Essi sono ampiamente disponibili e la loro nervo sciatico lesionato fornisce una ragionevole approssimazione delle lesioni nervose umane 5,4. Anche se di dimensioni inferiori rispetto ratto del nervo, il nervo mouse è dotato di molte qualità simili. Ma, soprattutto, mousmodelli E sono sempre più prezioso per l'ampia disponibilità di linee transgeniche permette ora una dissezione dettagliata delle singole molecole fondamentali per la rigenerazione del nervo 6, 7. Precedenti ricercatori hanno usato diversi metodi per produrre uno schiacciamento del nervo o lesioni anche semplici pinzette angolate, pinze fredde, pinze emostatiche, pinze vascolari, e morsetti investigatore progettati 8,9,10,11,12. Gli investigatori hanno anche utilizzato vari metodi di marcatura del sito procurando lesioni sutura, particelle di carbonio e perline fluorescenti 13,14,1. Descriviamo il nostro metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico riproducibile completa con un accurato e persistente marcatura del crush-sito utilizzando una pinza emostatica e sottili di carbonio conseguente schiacciamento-site marcatura. Come parte della nostra descrizione della procedura crush del nervo sciatico abbiamo anche incluso un metodo relativamente semplice di montare tutto muscoli che usiamo per quantificare successivamente rigenerazione.
Protocol
Discussion
Abbiamo presentato un metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico affidabile completo con marcatura precisa del sito cotta. Come accennato in precedenza, crush del nervo sciatico è un modello comune di lesione dei nervi periferici nei topi e nei ratti. Sebbene ogni metodo di compressione ha i suoi vantaggi e svantaggi, abbiamo trovato questo metodo ha prodotto una cotta completo che era facilmente contrassegnata con un minimo di attrezzature speciali (ad esempio pinze speciali, ecc.)
<p class="jove_st…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIH K08NS065157 (al TAF) Inoltre, il Centro Penn per disordini muscoloscheletrici, Numero P30AR050950 Award dal National Institute of Arthritis, malattie del sistema muscoloscheletrico e Pelle sostenuto questo lavoro (TAF e Steven S. Scherer). Infine, Shriners Pediatric Research finanziamento Seed Center (TAF) ha sostenuto questo lavoro. Vorremmo ringraziare il dottor Young-Jin Son inizialmente per dimostrare tutta la procedura di montaggio e di Amy A. Kim per la sua assistenza nella produzione i disegni della figura 1.
Materials
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Mini Clipper with No. 0000 Blade | Roboz | RC-5903 |
| Nair Hair Remover (9 oz.) | Church and Dwight Co., Inc. | N/A |
| Betadine Surgical Scrub (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 |
| Ophthalmic Ointment (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Surgical Tools:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| FST 250 Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Scissors (11 cm long) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) | World Precision Instruments | 14124-G |
| Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Powdered Activated Carbon (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-11 |
| Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| 0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Surgical Platform and Retractors:
(purchased at local hardware store)
| Name (description/) | Quantity |
| Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) | 1 |
| Button Magnets (Example: Eclipse E825) | 3 |
| Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) | 3 |
| Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) | 9 |
| Rubber Bands (Light Tension) | 3 |
| Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) | 3 |
Semi-Thins:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylene Oxide (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blue (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific | Jackson ImmunoResearch | 115-095-205 |
| DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mounting Medium (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
References
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