Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular
Summary
Neste relatório nós descrevemos um método para esmagamento do nervo ciático do rato. Este método usa prontamente disponíveis pinça hemostática e facilmente reproduzível e produz esmagamento do nervo ciático completa. Além disso, nós descrevemos um método para preparar montagens de músculos inteiros adequados para análise da regeneração do nervo após esmagamento do nervo ciático.
Abstract
Regeneração do sistema nervoso periférico (SNP) é amplamente estudada tanto pela sua importância para as doenças humanas e para entender a resposta robusta regenerativo montado pelos neurônios do SNP, assim, possivelmente, iluminando as falhas do CNS regeneração 1. Esmagamento do nervo ciático (axoniotmese) é um dos modelos mais comuns de lesão do nervo periférico em roedores 2. Esmagamento interrompe todos os axônios, mas Schwann lâminas de células basais são preservados para que a regeneração é ideal 3,4. Isto permite que o investigador para estudar precisamente a capacidade de um axónio crescente para interagir com tanto a célula de Schwann e as lâminas basais 4. Ratos foram geralmente os modelos animais preferidos para esmagamento do nervo experimental. Eles são amplamente disponíveis e seu nervo lesado fornece uma aproximação razoável das lesões nervosas humanas 5,4. Embora menor em tamanho do que rato nervo, o nervo do mouse tem muitas qualidades semelhantes. Mais importante, porém, mousmodelos E são cada vez mais valiosa porque a grande disponibilidade de linhas transgénicas permite agora uma dissecção detalhada das moléculas individuais críticos para a regeneração do nervo 6, 7. Antes investigadores usaram vários métodos para produzir uma queda ou lesão do nervo, incluindo simples fórceps, pinças anguladas refrigerados, pinças hemostáticas, braçadeiras e fixações, vasculares, investigador-concebidas 8,9,10,11,12. Os pesquisadores também utilizaram vários métodos para marcar o local da lesão, incluindo sutura, partículas de carbono e partículas fluorescentes 13,14,1. Nós descrevemos o nosso método para obter um esmagamento do nervo ciático reprodutivelmente completa com precisão e persistente marcação do local de esmagamento utilizando uma pinça fina hemostáticos e carbono subsequente esmagamento do local de marcação. Como parte de nossa descrição do procedimento de esmagamento do nervo ciático incluímos também um método relativamente simples de montar todo músculo que usamos para quantificar a regeneração posteriormente.
Protocol
Discussion
Nós apresentamos um método para obter um esmagamento do nervo ciático confiável completa com marcação precisa do local do esmagamento. Como mencionado anteriormente, esmagamento do nervo ciático é um modelo comum de lesão do nervo periférico em ratinhos e ratos. Apesar de cada método de esmagamento tem as suas vantagens e desvantagens, encontramos este método produziu uma queda completa que foi facilmente marcado com um mínimo de equipamento especial (por exemplo, braçadeiras especiais, etc).
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede K08NS065157 (a TAF) Além disso, o Centro Penn para lesões músculo-esqueléticas, P30AR050950 Prêmio Número do Instituto Nacional de Artrite, Doenças músculo-esqueléticas e da pele apoiaram este trabalho (TAF e Steven S. Scherer). Finalmente, Shriners Pediatric Research financiamento semente Center (TAF) apoiaram este trabalho. Nós gostaríamos de agradecer o Dr. Young-Jin Son inicialmente para demonstrar todo o processo de montagem e Amy A. Kim por sua ajuda na produção dos desenhos da Figura 1.
Materials
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Mini Clipper with No. 0000 Blade | Roboz | RC-5903 |
| Nair Hair Remover (9 oz.) | Church and Dwight Co., Inc. | N/A |
| Betadine Surgical Scrub (1 gallon) | Fisher Scientific | 19066452 |
| Ophthalmic Ointment (1 oz.) | Fisher Scientific | 19082795 |
Surgical Tools:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| FST 250 Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Scissors (11 cm long) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) | World Precision Instruments | 14124-G |
| Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Powdered Activated Carbon (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) | Roboz | SUT-1073-11 |
| Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| 0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Surgical Platform and Retractors:
(purchased at local hardware store)
| Name (description/) | Quantity |
| Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) | 1 |
| Button Magnets (Example: Eclipse E825) | 3 |
| Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) | 3 |
| Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) | 9 |
| Rubber Bands (Light Tension) | 3 |
| Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) | 3 |
Semi-Thins:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylene Oxide (450 mL) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blue (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:
| Name (description/quantity) | Supplier | Catalogue Number |
| Paraformaldehyde (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 mL) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycine, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) | Covance | SMI-312R |
| Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific | Jackson ImmunoResearch | 115-095-205 |
| DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Mounting Medium (10 mL) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) | Fisher Scientific | 12-548-5C |
References
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