عزل الخلايا القاعدية والخلايا تحت المخاطية قناة الغدة من القصبة الهوائية ماوس
Summary
هنا علينا أن نبرهن بروتوكول لدينا لعزل الخلايا القاعدية وتحت المخاطية قناة الغدة من القصبات الماوس. علينا أن نبرهن أيضا طريقة حقن الخلايا الجذعية في لوحة الماوس الدهون الظهرية لإنشاء<em> في الجسم الحي</em> نموذج للتجديد الغدة تحت المخاطية.
Abstract
الشعب الهوائية الكبيرة على اتصال مباشر مع البيئة وبالتالي عرضة للإصابة من السموم والعوامل المعدية أننا في التنفس 1. الشعب الهوائية الكبيرة تتطلب بالتالي إصلاح آلية فعالة لحماية أجسامنا. هذه العملية يحدث إصلاح من الخلايا الجذعية في الشعب الهوائية وعزل هذه الخلايا الجذعية من الشعب الهوائية من المهم لفهم آليات الإصلاح والتجديد. من المهم أيضا لفهم إصلاح الشاذة التي يمكن أن تؤدي إلى أمراض الشعب الهوائية 2. والهدف من هذا الأسلوب هو لعزل الخلايا الجذعية من رواية سكان القصبة الهوائية الماوس القنوات الغدة تحت المخاطية ووضع هذه الخلايا في المختبر في وأنظمة نموذج الجسم الحي للتعرف على آليات إصلاح وتجديد الغدد تحت المخاطية 3. يظهر هذا الإنتاج الأساليب التي يمكن استخدامها لعزل وفحص الخلايا الجذعية لاصق والقاعدية من الشعب الهوائية كبيرة 3، مما سيسمح لنالدراسة أمراض الشعب الهوائية، مثل التليف الكيسي، الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. حاليا، لا توجد طرق لعزل خلايا الغدة تحت المخاطية القناة وليس هناك أي نماذج في الجسم الحي لدراسة تجديد الغدد تحت المخاطية.
Protocol
Discussion
هذه التقنية لعزل الخلايا القاعدية والقناة من الشعب الهوائية من المهم لتحسين فهمنا للإصلاح والتجديد الهوائية وأمراض الشعب الهوائية. التقنيات الموضحة هنا تشمل على بعد خطوات قليلة حرجة. الأول هو الأمثل فترة الهضم الأنزيمي. والثاني هو إنشاء خلية واحدة من خلال التعليق ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف الخلايا الجذعية واسع FACS مركز البحوث وأشكر خصوصا جيسيكا سكولز وكودريا فيليسيا لمساعدتهم مع الفرز الخلية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل CIRM RN2-00904-1، K08 HL074229، وجمعية أمراض الصدر الأميركية / COPD مؤسسة ATS-06-065، المؤسسة المعنية وUCLA جونسون المركز الشامل للسرطان الصدر SPORE الأورام السرطانية برنامج / الرئة، سرطان في جامعة كاليفورنيا البحث جنة التنسيق وهازن غوين الكرز التذكارية المختبرات (BG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI |
| Amphotericin B (0.25 μg/ ml) | Lonza | 17-836R |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 |
Table 1. Complete media components.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea.
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
