Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu
Summary
Burada fare tracheas bazal ve submukozal bez kanal hücrelerinin izolasyonu için bizim protokol göstermektedir. Ayrıca, bir oluşturmak için dorsal fare yağ yastığı içine kök hücreleri enjekte yöntem gösterilmektedir<em> In vivo</emSubmukozal bez rejenerasyon> modeli.
Abstract
Büyük hava yollarının 1. biz nefes toksinler ve enfeksiyöz ajanlar yaralanma nedenle duyarlı çevre ile doğrudan temas halinde olan ve. Büyük hava yollarının nedenle etkin bir tamir mekanizması vücudumuzun korumak için gerektirir. Bu onarım sürecinde solunum yollarında kök hücrelerden oluşur ve solunum yollarının bu kök hücreler izole onarım ve rejenerasyon mekanizmalarının anlaşılması için önemlidir. Bu hava yolu hastalıkları 2 yol açabilir anormal onarımı anlamak için de önemlidir. Bu yöntemin amacı fare trakeal submukozal bez kanallarından bir roman kök hücre popülasyonu izole etmek ve submukozal bezlerin 3 tamir ve rejenerasyon mekanizmalarının belirlenmesi, in vitro ve in vivo model sistemlerde bu hücrelerin yerleştirmektir. Bu üretim, büyük hava yollarının 3 kanal ve bazal kök hücreler izole ve test için kullanılan yöntem gösterilmektedir. Bu sayede sağlayacakBu tür kistik fibrozis, astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi solunum yolu hastalıkları, çalışma. Şu anda, submukozal bez kanal hücrelerinin izole edilmesi için bir yöntem bulunmamaktadır ve mukozal bezlerin yenilenme çalışmak için in vivo modellerde de yoktur.
Protocol
Discussion
Solunum kanal ve bazal hücrelerin izole edilmesi Bu teknik hava yolu onarımı ve yenilenmesi ve hava yolu hastalıkları anlayışımızı geliştirmek için önemlidir. Burada açıklanan teknikleri birkaç kritik adımları içerir. İlk Optimize enzimatik sindirim dönemdir. İkinci hücre kesme önlemek ama hücre kümeleri kırmak için giderek daha yüksek ölçer iğne ile pasajlanmasını seri boyunca tek bir hücre süspansiyonu yaratılmasıdır. Üçüncü FACS analizi ve uygun antikorlar ile hücrelerin ga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Geniş Kök Hücre Araştırma Merkezi FACS kabul ve özellikle hücre sıralama ile yardım için Jessica Scholes ve Felicia Codrea teşekkür etmek istiyorum. Iş CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, Amerikan Toraks Derneği / KOAH Vakfı ATS-06-065, endişe Vakfı, UCLA Jonsson Kapsamlı Kanser Merkezi Göğüs Onkoloji Programı / Akciğer Kanseri SPORE, Kaliforniya Kanser Üniversitesi tarafından finanse edildi Araştırma Koordinasyon Komitesi ve Gwynne Hazen Kiraz Memorial Laboratuvarları (BG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI |
| Amphotericin B (0.25 μg/ ml) | Lonza | 17-836R |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 |
Table 1. Complete media components.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea.
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
