Aislamiento de células basales y de células submucosas conducto de la glándula de ratón tráquea
Summary
Aquí demostramos nuestro protocolo de aislamiento de las células de los conductos glandulares basales y submucosa de tráqueas de ratón. También se demuestra el método de la inyección de células madre en la alfombrilla del ratón grasa dorsal para crear un<em> In vivo</em> Modelo de regeneración glándula submucosa.
Abstract
Las vías respiratorias están directamente en contacto con el medio ambiente y por lo tanto susceptibles a las lesiones de las toxinas y agentes infecciosos que se respira en 1. Las vías respiratorias grande por lo que requieren un mecanismo de reparación eficaz para proteger a nuestros cuerpos. Este proceso de reparación se produce a partir de células madre en las vías respiratorias y el aislamiento de estas células madre de las vías respiratorias es importante para la comprensión de los mecanismos de reparación y regeneración. También es importante para la comprensión de reparación anormal que puede conducir a enfermedades de las vías 2. El objetivo de este método consiste en aislar una población de células madre de ratón novela de los conductos de las glándulas submucosas traqueales y para colocar estas células in vitro y en modelos de sistemas in vivo para identificar los mecanismos de reparación y regeneración de las glándulas submucosas 3. Esta producción muestra métodos que pueden ser utilizados para aislar y ensayo de las células madre del conducto y basal de la gran vías respiratorias 3. Esto nos permitirápara estudiar las enfermedades de las vías respiratorias, tales como la fibrosis quística, el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En la actualidad, no existen métodos para el aislamiento de células de las glándulas submucosas y conductos no hay modelos in vivo para estudiar la regeneración de las glándulas submucosas.
Protocol
Discussion
Esta técnica para aislar células de los conductos y basal de las vías respiratorias es importante para mejorar nuestra comprensión de la reparación de las vías respiratorias y las enfermedades de las vías respiratorias y regeneración. Las técnicas descritas aquí son algunas medidas críticas. El primero es el período optimizado digestión enzimática. La segunda es la creación de una única suspensión celular a través de pasada en serie con agujas de calibre progresivamente más altas para prevenir la rotu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer el amplio FACS de células madre del Centro de Investigación y sobre todo gracias a Jessica Scholes y Codrea Felicia por su ayuda con la clasificación de células. El trabajo fue financiado por el CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / COPD Foundation ATS-06-065, La Fundación preocupación, la UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / SPORE pulmón Cáncer, la Universidad de California del Cáncer Investigación Comité de Coordinación y el Gwynne Hazen cereza Memorial Laboratories (BG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI |
| Amphotericin B (0.25 μg/ ml) | Lonza | 17-836R |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 |
Table 1. Complete media components.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea.
References
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
