Retrograde Perfusie en vullen van Muis coronaire bloedvaten als voorbereiding op Micro Computed Tomography Imaging

Summary

Visualisatie van de coronaire bloedvaten is van cruciaal belang voor het bevorderen van onze kennis van hart-en vaatziekten. Hier beschrijven we een methode voor perfuseren muizen coronaire bloedvaten met een contrastmiddel siliconen rubber (Microfil), ter voorbereiding van micro-Computed Tomography (μCT) beeldvorming.

Abstract

Visualisatie van het vaatstelsel wordt steeds belangrijker voor het begrijpen van een groot aantal verschillende ziektebeelden. Hoewel diverse technieken bestaan ​​voor beeldvorming vaatstelsel weinig kunnen het vasculaire netwerk als geheel zichtbaar, terwijl de uitbreiding van een resolutie die de kleinere vaartuigen ^1,2 bevat. Daarnaast hebben veel vasculaire giettechnieken vernietigen het omliggende weefsel, het voorkomen van verdere analyse van het monster ^3-5. Een methode waarin deze aspecten worden omzeilt is micro-Computed Tomography (μCT). μCT beeldvorming kan scannen met een resolutie <10 micron, is geschikt voor het produceren 3D-reconstructies van de vasculaire netwerk, en laat het weefsel intact voor verdere analyse (bijvoorbeeld, histologie en morfometrie) ^6-11. Echter, imaging schepen door ex vivo μCT methoden vereist dat de vaten worden gevuld met een contrastmiddel verbinding. Als zodanig is de juiste weergave van de bloedvaten die door μCT beeldvorming is afhankelijk vanbetrouwbare en volledige vulling van de schepen. In dit protocol beschrijven we een techniek voor het vullen van de muis coronaire vaten ter voorbereiding van μCT beeldvorming.

Twee overheersen technieken bestaan ​​voor het vullen van de coronaire bloedvaten: in vivo via infusen en retrograde perfusie van de aorta (of een tak van de aortaboog) ^12-14, of ex vivo via een Langendorff perfusiesysteem ^15-17. Hier beschrijven we een in-vivo aorta cannulatie methode die speciaal is ontworpen om ervoor te zorgen het vullen van alle schepen. We gebruiken lage viscositeit radiopake verbinding genoemd Microfil die wordt doorstroomd door de kleinste schepen de capillairen, evenals zowel de arteriële en veneuze zijden van het vasculaire op te vullen. Schepen worden geperfuseerd met buffer onder druk wordt perfusie-systeem, en vervolgens gevuld met Microfil. Om ervoor te zorgen dat Microfil vult de kleine hogere weerstand schepen, we afbinden van de grote takken emanating van de aorta, die het Microfil afleidt in de kransslagaders. Na het vullen is voltooid, de elastische aard van hartweefsel voorkomen knijpen Microfil uit van enkele schepen, we ligeren toegankelijk belangrijke vasculaire exit-punten onmiddellijk na het vullen. Daarom wordt onze techniek geoptimaliseerd voor volledige vulling en een maximaal behoud van het vulmiddel, zodat visualisatie van de volledige coronaire vasculaire netwerk – slagaders, haarvaten en aders gelijk.

Protocol

1. Voorbereidingen voor het starten Vul elke zijde van de druk perfusie inrichting met vaatverwijdende buffer (4 mg / L Papaverine + 1 g / L Adenosine in PBS) of 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, respectievelijk. Maak een 1/2cc insulinespuit (met een gegoten, 29g ½ "naald) door deze te vullen met 0,1 ml van 1:100 Heparine (5000U/ml voorraad) en het buigen van de naald tot ~ 120 graden hoek met de schuine kant op. Doe de Hetzelfde met een 1 ml spuit (met een 26G ½ "naald) gevuld met 0,3 m…

Discussion

Hartweefsel heeft een zeer hoog metabolisme, en vereist dan ook een constante toevoer van voedingsstoffen en zuurstof uit het bloed geleverd door de coronaire vaten. Ziekten van de kransslagaders, die coronaire functie als gevolg van de schepen stenose en verstopping te verminderen, kan leiden tot weefsel hypoxie en ischemie, en zet de getroffen patiënten met risico op myocardinfarct en onherstelbare schade aan de hartspier. Een beter begrip van de zieke toestand van deze schepen is noodzakelijk en van cruciaal belang …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1 ml syringes	Becton Dickinson	BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles	Becton Dickinson	BD-309306
2″ x 2″ Gauze pads	Med101store.com	SKU 2208
24G ¾” Angiocath IV catheter	Becton Dickinson	BD-381112
26G ½”gauge needles	Becton Dickinson	BD-305111
Adenosine	Sigma	A9251	1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile	Cardinal Health	C15055-006
Curved Surgical Scissors	Fine Science Tools	14085-09
Dissecting stereoscope and light source	Nikon	NA	NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches	Cole-Parmer	YO-10915-12	Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps	Aesculap	FD281R	Need two
Heparin, 5000 U/ml stock	APP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-047-10	1:100 dilution in water
KCl	Fisher	P217	Saturated solution in H2O
Ketamin  (Ketaset), 100 mg/ml stock	Fort Dodge, Overland Park, KS, USA	NDC 0856-2013-01	Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil	Flow Tech	MV-122 (yellow). Other color options are also available.	Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk	Harvard Apparatus	723287
Papaverine	American Regent Inc.	NDC 0517-4010-01	4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus			See figure 2
Spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock	Lloyd Labs	NADA #139-236	Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline