Ретроградная перфузия и заполнение мыши коронарных артерий, как подготовка к Micro компьютерной томографии изображений
Summary
Визуализация коронарных сосудов имеет решающее значение для продвижения нашего понимания сердечно-сосудистых заболеваний. Здесь мы опишем метод перфузии мышиных коронарных артерий с резиновой рентгеноконтрастные силиконовые (Microfil), в рамках подготовки к микро-компьютерной томографии (μCT) изображений.
Abstract
Визуализация сосудистой становится все более важным для понимания различных болезненных состояний. Хотя существует несколько методов для визуализации сосудистой, немногие из них способны визуализировать сосудистую сеть в целом в то время как расширение к резолюции, которая включает в себя более мелкие суда 1,2. Кроме того, многие сосудистые методы литья уничтожать окружающие ткани, предотвращая дальнейший анализ образцов 3-5. Один из методов, который обходит эти вопросы, является микро-компьютерной томографии (μCT). μCT можете сканировать изображения с разрешением <10 мкм, способна производить 3D-реконструкция сосудистой сети, и оставляет нетронутыми ткани для последующего анализа (например, гистологии и морфометрии) 6-11. Тем не менее, изображение суда экс естественных методов μCT требует, чтобы суда заполнена рентгеноконтрастного вещества. Таким образом, точное представление о сосудистой производства μCT визуализация зависит отдостоверного и полного наполнения сосудов. В этом протоколе описываются методики для заполнения мыши коронарных сосудов при подготовке изображений μCT.
Два преобладают методы существуют для заполнения коронарных артерий: в естественных условиях с помощью катетеризации и ретроградной перфузии аорты (или отделение от дуги аорты), 12-14, или бывших естественных условиях через систему Langendorff перфузии 15-17. Здесь мы опишем в естественных условиях катетеризации аорты метод, который был специально разработан, чтобы обеспечить заполнение всех судов. Мы используем низкую вязкость рентгеноконтрастное соединение называется Microfil который может заливать через мельчайшие сосуды, чтобы заполнить все капилляры, а также как артериальных и венозных стороны сосудистой сети. Сосуды озарен буфера с помощью системы перфузии под давлением, а затем заполнены Microfil. Для того, чтобы Microfil заполняет небольшую высших судов сопротивление, мы перевязывать крупные ветви emanatinг от аорты, которая отвлекает Microfil в коронарные артерии. После завершения заполнения, чтобы не допустить упругий характер сердечной ткани от сжатия Microfil из некоторых судов, мы перевязывать доступны основных сосудистых точек выхода сразу после заполнения. Таким образом, наша техника оптимизирована для полного заполнения и сохранения максимальной наполнителя, что позволяет визуализировать полный коронарных сосудов сети – артерий, капилляров, вен и так.
Protocol
Discussion
Сердечная ткань имеет очень высокую метаболическую спрос и, следовательно, требует постоянного поступления питательных веществ и кислорода из крови доставлен в коронарных сосудов. Заболевания коронарных сосудов, которые уменьшают коронарный функции из-за стеноз сосудов и блокировк?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Келли Стивенс для начальных попыток протокола, д-р Майкл Симмонс, доктор Кип Hauch и членов обоих своих лабораториях для общего обсуждения.
Эта работа является поддержка грантов NIH HL087513 и P01 HL094374.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | BD-309602 | |
| 1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | Becton Dickinson | BD-309306 | |
| 2″ x 2″ Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾” Angiocath IV catheter | Becton Dickinson | BD-381112 | |
| 26G ½”gauge needles | Becton Dickinson | BD-305111 | |
| Adenosine | Sigma | A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
| Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile | Cardinal Health | C15055-006 | |
| Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| Dissecting stereoscope and light source | Nikon | NA | NA |
| Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer | YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
| Fine Curved Forceps | Aesculap | FD281R | Need two |
| Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
| KCl | Fisher | P217 | Saturated solution in H2O |
| Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge, Overland Park, KS, USA | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
| Microfil | Flow Tech | MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
| Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus | 723287 | |
| Papaverine | American Regent Inc. | NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Prepared as 4% solution |
| Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd Labs | NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |
References
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
- Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
- Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
- Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
- Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
- Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
- Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
- Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
- Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
- Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
- Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
- Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts–technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
- Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
- Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
- Quintana, L., Sharpe, J. . Optical projection tomography of vertebrate embryo development. , 586-594 (2011).
- Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
- Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
- Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
- Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
- Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
- Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
- Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
- Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
- Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
- Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
- Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. , 254-441 (2010).
