Scanning af HIV-1 Envelope-induceret Virologisk Synapse og signaler på syntetiske lipiddobbeltlagenes

Summary

Denne artikel beskriver en fremgangsmåde til at visualisere dannelse af en HIV-1 envelope-induceret virologisk synapse på glas understøttet plane dobbeltlag ved total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Fremgangsmåden kan også kombineres med immunfluorescensfarvning at detektere aktivering og omfordeling af signalmolekyler, der opstår under HIV-1 envelope-induceret virologiske synapsedannelse.

Abstract

Humant immundefektvirus type 1 (HIV-1) infektion forekommer mest effektivt via celle til celle transmission ^2,10,11. Denne celle til celle overdragelse mellem CD4 ^+-T-celler involverer dannelsen af en virologisk synapse (VS), som er en F-actin-afhængig celle-celle-forbindelsen dannet ved indgreb af HIV-1 hylster gp120 på den inficerede celle med CD4 og chemokinreceptor (CKR) CCR5 eller CXCR4 på målcellen ^8. Ud over gp120 og dets receptorer, andre membranproteiner, især adhæsionsmolekyleaktiviteter LFA-1 og dets ligander, ICAM-familien spiller en vigtig rolle i VS dannelse og virusoverførsel som de er til stede på overfladen af ​​virusinficerede donorceller og målceller samt på kappen af HIV-1 virioner ^{1,4,5,6,7,13.} VS dannelse også ledsages af intracellulære signaleringsbegivenheder, der er transduceret som et resultat af gp120-indgreb af dets receptorer. Faktisk har vi for nylig viste, at CD4 <sup> + T-celle interaktion med gp120 inducerer rekruttering og phosphorylering af signaleringsmolekyler forbundet med TCR signalosome herunder Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, og PLCγ ^15.

I denne artikel præsenterer vi en metode til at visualisere supramolekylære arrangement og membran-proksimale signal begivenheder, der finder sted i VS dannelse. Vi benytte glas-understøttede plane dobbeltlag system som reduktionistisk model til at repræsentere overfladen af ​​HIV-inficerede celler, der bærer den virale kappe gp120 og det cellulære adhæsionsmolekyle ICAM-1. Protokollen beskriver generelle fremgangsmåder til overvågning af HIV-1 gp120-induceret VS samling og signalsekvenser aktivering begivenheder, der omfatter i) dobbeltlag fremstilling og samling i en strømningscelle, ii) injektion af celler og immunfluorescensfarvning at detektere intracellulære signalmolekyler på celler interagerende med HIV-1 gp120 og ICAM-1 på bi-lag, iii) billedoptagelse ved TIRF mikroskopi, ennd iv) dataanalyse. Dette system frembringer højopløsningsbilleder af VS grænseflade end den, der opnås med den konventionelle celle-celle-system, da den tillader påvisning af forskellige klynger af individuelle molekylære bestanddele af VS sammen med specifikke signalmolekyler rekrutteret til disse subdomæner.

Protocol

1. Mærkning Gp120

Fluorescerende farvestoffer, der anvendes i denne protokol er effektive til at binde til proteiner, er tilstrækkeligt foto-stabil for mikroskopi billedbehandling, og matche excitationsbølgelængder af lasere til rådighed med vores mikroskop. Disse tre kriterier skal være opfyldt, når der vælges fluorescerende molekyler til kodning proteiner.

1. Udveksling _His6-mærket gp120 DH12 (en gave fra Dr. Michael Cho, Iowa State University) protein puffer til sterilt PBS under anvendelse af en centrifugalfilterenhed (30 kDa MWCO). Sørg for, at gp120 koncentration er ikke mere end 1 mg / ml. Note: His _6-mærket gp120-proteiner fra andre X4 eller R5 tropiske stammer er også blevet testet og er nu kommercielt tilgængelige fra Immune Technologies.
2. Tilsættes natriumbicarbonat, pH 9,0 til protein-opløsning til opnåelse af 50 mM slutkoncentration af natriumbicarbonat med ~ pH 8,5.
3. Tilsættes aminreaktive Alexa Fluor 488 (AF488) fluorescerende farvestof, som er dissolved i vand ved en 10-fold molært overskud. Inkuber blandingen i 1-2 timer ved stuetemperatur i mørke.
4. At fjerne overskydende farvestof, anvende centrifugalfilterenhed som før, og der tilsættes frisk sterilt PBS til søjlen. Gentag dette trin, indtil alle gratis farvestof fjernes (3-4 gange vask med 4 ml PBS). Spin ned, indtil gp120 koncentreres til cirka 1 mg / ml. Bemærk: Fjernelse af frit farvestof ved dialyse eller centrifugalfilterenhed fungerer kun, hvis farvestoffet er vandopløseligt, ellers gelfiltrering kan anvendes.
5. At måle fluorescens-intensiteten per molekyle protein (F / P) af det mærkede protein bestemmes koncentrationerne (i uM) af det fluorescerende farvestof ved den passende bølgelængde (fx ved 488 nm for AlexaFluor 488) og protein (vi anvender en NanoDrop spektrofotometer ved hjælp af de 'proteiner og labels' indstilling) og derefter dividere disse to numre giver dig F / P-forholdet. Den samme procedure anvendes til andre proteiner og farvestoffer, såsom ICAM-1 og Cy5. Bemærk: Andre typer spectrophotometers kan anvendes til opnåelse af proteinkoncentrationen og fluorescerende farvestof koncentration til opnåelse af F / P-forholdet hvis NanoDrop ikke er tilgængelig.

2. Flow Cell Montering og tolag Forberedelse

Den generelle procedure for flow-celle og dobbeltlaget fremstilling er blevet beskrevet i detaljer tidligere ^14. Her skitserer vi specifikt protokollen til at forberede dobbeltlag som indeholder Hans _6-mærket gp120 DH12 på en Bioptech flow celle. Til undersøgelser med infektiøse virus eller inficerede celler, og når små volumener er nødvendigt på grund af begrænsede reagenser, en engangs Ibidi strømningskammer (klæbrig Slide I ^0,2 Luer) kan anvendes, og følges med den samme dobbeltlag præparat procedure i trin 2.4-2.9. Information for Ibidi strømningskamre kan fås fra selskabets hjemmeside, http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf

1. Fremstille Pirhana opløsning (45 ml svovlsyre (spormetal Grade 98%) og 15 ml 30% hydrogenperoxid) ^14. Med plastklemmer, glider nedsænkes dækning i Pirhana løsning for 15 minutter.
2. Overførsel dækglas til et bægerglas fyldt med Pica-oprenset vand og vaskes hver under rindende vand i 2 min (ét minut på hver side). Sted på rack til tørre.
3. Samle Bioptechs FCSII kamre som tidligere beskrevet ^14.
4. Et liposom blanding indeholdende 12,5% ^{Ni2 +} chelaterende lipider anvendes til at indfange og præsentere _His6-gp120 på dobbeltlaget overfladen ^16. Tilsæt 1 gl dråber af liposom blandingen på microaqueduct slide uden at røre spidsen til glasset. Til fremstilling af et maksimum af 5 dobbeltlag pr flowcelle, gentages op til 4 gange mere, således at der er fem 1 pi prikker, som vist tidligere ^14.
5. Placere dækglasset på toppen af ​​lipider. Omfatte hvid holderingen med en rustfri clamp baseenhed, vend det hele apparatet over og forsegle. Markere placeringen af ​​dobbeltlag med en markør. Inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
6. Vedhæfte rør med to-vejs stophane til venstre perfusion rør, som vist i video. Give en positiv menisk ved enden af ​​røret med den 3-vejs hane på den (slange tidligere er blevet fyldt med HEPES-bufret saltvand (HBS) indeholdende human serumalbumin (HSA) (HBS / HSA: 50 ml 10 x HBS [10x HEPES-bufret saltvand: 200 mM HEPES, pH 7,2, 1,37 M NaCl, 50 mM KCI, 7 mM _{Na2HPO 4,} 60 mM D-glucose] 20 ml 25x HSA 500 ​​pi 1 M _CaCl2, 1 ml 1 M _MgCl2 og dH ₂ 0 bringe et totalvolumen på 500 ml og filtreres med 0,22 um filter) og er fri for bobler. forbindelse slangen mod højre perfusion rør og forsigtigt skubbe puffer gennem flowcellen.
7. Bloker dobbeltlag med ~ 300 pi casein indeholdende 100 uM _NiCl2 ved fyldning 1 ml sprøjte og er knyttet til den åbne del af tre-vejs stophane. Gently skubbe puffer gennem og lukke begge stophaner før frakobling af sprøjten. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
8. Tilsættes _His6-mærket AF488-mærket gp120 (koncentrationen bestemmes som tidligere beskrevet i ^16). Vi anvender ~ 250 molekyler gp120/μm ² til at efterligne den lokale densiteten af Env klynger, der findes på HIV-1-virion overflade ^17. Tilsvarende anvender vi ~ 250 molekyler / um ² i ICAM-1 på dobbeltlaget som tidligere rapporteret ^14. Læg i flowcellen som det er gjort med kasein. Inkuber i 30 minutter i mørke (dække med folie) ved stuetemperatur. Den samme procedure anvendes til at inkorporere andre proteiner, såsom His _12-mærket Cy5-mærkede ICAM-1 på dobbeltlaget.
9. Vask dobbeltlag med 5 ml buffer.

3. Kvalitetskontrol af dobbeltlag via FRAP

Proteiner i dobbeltlag være lateralt diffunderbar. Før tilsætning af celler på dobbeltlag, er det vigtigt at sikremobilitet af proteiner i den fremstillede dobbeltlaget. Her beskriver vi en fluorescerende Recovery Efter Fotoblegning (FRAP) metode ^3, som kan udføres manuelt på de fleste objektive belyst TIRF, brede felt epifluorescens, eller laser konfokal mikroskoper. Målet er at afbilde fuldt ensartede områder fluorescens i lipiddobbeltlaget, blegemiddel en plet, og at overvåge tilbagevenden quenchede molekyler til den blegede området. Et krav om tilbagebetaling på 50% i 2 minutter kan være acceptabelt. Alle de store mikroskop producenter (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) sælge objektive oplyste TIRF systemer, der fungerer godt for denne ansøgning. Mens hver virksomhed giver variationer af TIRF belysning og andre operationelle karakteristika, billedkvaliteten er stort set den samme.

1. Anvende en lav excitationsintensitet at minimere blegning. Brug en høj numerisk apertur mål såsom en NA 1,3 til 1,45 40x, 60x eller 100x. Når der anvendes en standard fluorescerende eller TIRF mikroskop for at reducere de lette intensetet, sættes neutralfiltre i excitationslyset bane. De fleste laser systemer kan indstilles til lav belysning ved at sætte en acusto optisk afstemmelige filter (AOTF) eller acusto optisk stråledeler (AOB'er) med lav spænding.
2. Optag en "pre-blegemiddel" billede. Hvis du bruger en kølet CCD-kamera, for at kompensere for dårlige lysforhold Binning kan sættes til 2x2 eller 4x4, kan gevinsten blive sat højt, eller lange eksponeringer (for eksempel på størrelsesordenen sekunder) kan anvendes. Hvis du bruger en konfokal, kan pinhole blænden åbnes; gevinsten sat højt, og langsom scanning eller i gennemsnit brugt.
3. Bleach et sted. Hvis du bruger en standard fluorescens eller TIRF mikroskop, alle ND-filtre fjerner for at tillade maksimal intensitet belysning, skal du lukke feltet mellemgulvet, og eksponere prøven i nogle få sekunder. Hvis du bruger en laser konfokal, indstille den laser magt maksimale og zoom i ca 4x til 8x at blege en plet. En advarsel til konfokal brug: ikke zoome ind på alt for høj, fordi dobbeltlaget, kan blive beskadiget af for stramsively koncentreret fotoner.
4. På ti til femten sekunders mellemrum, hjælp optage billeder af samme belysning og optagelse indstillinger som i 3,1 og 3,2. Inden for to til tre minutter stedet bør inddrive intensitet, der nærmer sig "pre-blegemiddel" billede. Quick recovery er tegn på en succesfuld mobil dobbeltlag. Hvis stedet forbliver mørk, og især hvis kanten bibeholder høj kontrast, at fluorescerende proteiner er immobile i dobbeltlaget, og bør ikke anvendes til eksperimentet.

Bemærk: I vores nuværende mikroskop, kan vi levere 0,9 mW 641 nm lys til en cirkulær plet med et areal på 240 um ^2, som bleger fluorescerende ICAM ved typiske koncentrationer på mindre end 4 sekunder. Læserne skulle finde, at kritiske tilpasning af en Hg eller Xe lampe med blegning gange mindre end 30 sekunder er mere end tilstrækkeligt til at udføre denne analyse på en gentagelig måde. Vi vil også henvise dig til Reference ³ for yderligere itfattes.

4. Injektion af celler og immunfluorescensfarvning

1. Varme op flowcellen til 37 ° C (dette kan gøres i en 37 ° C inkubator uden CO ₂ til omkring 30 minutter).
2. Tilsættes aktiverede humane CD4 ⁺ T-celler (2-5x10 ⁶ / flow-celle) i HBS / HSA ~ 400 pi af 1 ml sprøjte. Lod celler tillægger dobbeltlaget i ~ 45 minutter i 37 ° C inkubator. Hvis Ibidi kamre anvendes levere yderligere puffer hver 15-20 min.
3. Fiksere cellerne ved at injicere 2% paraformaldehyd og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
4. Vask 3X med 1 ml stuetemperatur PBS-buffer. Permeabilisere celler ved injektion af 0,1% Triton X-100 i 5 minutter ved stuetemperatur.
5. Vask 3X med 1 ml stuetemperatur PBS-buffer (ved probning af phosphorylerede proteiner, kan man tilføje natriumvanadat på 1 mM slutkoncentration eller en anden phosphatase inhibitor i PBS for at forhindre phosphatfjernelse under bearbejdning). Bloker med casein med 5% gedeserum i25 minutter ved stuetemperatur. Typen af ​​animalsk serum afhænger af det sekundære antistof.
6. Vaskes 3x med 1 ml stuetemperatur PBS-buffer. Tilsættes primært antistof i ~ 300 pi puffer / flowcellen i 30 min - 1 time ved stuetemperatur. At detektere den første membran-proksimale aktiveringssignal, bruger vi antistoffer specifikke for phosphoryleret Lck (pLck), total Lck eller Fyn.
7. Vaskes 3x med 1 ml stuetemperatur PBS-buffer. Tilsættes hensigtsmæssigt fluorescensmærket sekundært antistof i buffer, som sker med primært antistof. For vore eksperimenter, bruger vi Alexa Fluor 568-mærket gede-anti-kanin sekundært. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Vaskes 3x med 1 ml PBS-buffer.
8. Bemærk: Det er vigtigt at have en kontrol dobbeltlaget, der er behandlet med kun sekundært antistof (ingen primære antistof). Følg trin 4.1-4.5 og spring over 4,6, og fortsæt derefter med trin 4,7. Dette vil bestemme niveauet af ikke-specifik binding af den sekundære antistof. Alternativt kan man anvende direkte mærketed primære antistoffer.

5. Billede overtagelse af TIRF mikroskopi

TIRF mikroskopi tillader excitation af fluorescerende signaler begrænset til en 250 nm eller tyndere plane på glassubstratet og celle-grænsefladen. Dette sikrer billedoptagelse af kun signaler fra lipiddobbeltlaget og fra de umiddelbart apposed cellemembraner. Derfor er kun molekyler ved synapsen afbildes. Fordi TIRF billeder kun membran-proksimale område i bunden af ​​cellen, vil proteiner, der er internaliseret eller omfordeles i den dorsale membranen ikke blive detekteret. Det kan derefter være vigtigt at yderligere erhverve billeder ved standard widefield eller konfokal mikroskopi for at bestemme akkumulering eller distribution af proteinerne ved den synaptiske områder i forhold til de andre mængder af cellen.

Alle de store mikroskop producenter (Leica, Nikon, Olympus, Zeiss) sælge objektive oplyste TIRF systemer, der fungerer godt for dette APdelsen. Mens hver virksomhed giver variationer af TIRF belysning og andre operationelle karakteristika, billedkvaliteten er stort set den samme. Hver TIRF mikroskop har sine egne oplysninger om drift, men følgende generelle regler for at opnå høj-opløsning billeddannelse.

• Belysningen være lav for at undgå blegning.
• Kameraet skal have en lineær reaktion.
• Kameraet skal være i stand til billeddannelse af et bredt dynamisk interval uden mætning.
• Alle indstillinger skal sættes konstant til kvantitative analyser.

6. Dataanalyse

At studere de intracellulære signaler aktiveret som et resultat af CD4 ^+-T-celle interaktion med gp120 ved VS er kvantitative analyser af TIRF billeder udført for at bestemme, hvorvidt intracellulære signalmolekyler, såsom Lck og Fyn aktiveres og rekrutteres til synapsen ^15. Her beskriver vi en simpel metode anvendelig til de fleste billedanalyseprogrampakker som ImageJ og Metamorph. Vi har brugt ImageJ, der kører på Windows, Macintosh og Linux, for vores metode her ^12.

I Analyser> Set Målinger fanen, skal du markere afkrydsningsfelterne for området og betyder, grå værdi. Når du laver et område af interesse på det billede, er en polygon eller frihånd spores lukket form og har Analyze> Mål, vil softwaren lægge data fra denne måling i resultat tabellen. Området vil være i antallet af pixels eller i um ^2. Gennemsnittet er den gennemsnitlige intensitet i arbitrære enheder. Det skal have baggrund intensitet subtraheret fra det. Multiplicere middelværdien minus baggrund af området returnerer den integrerede intensitet af proteinet i arbitrære enheder.

1. Indstil målingerne i Mean og Area.
2. Åbne billeder for en eksperimentel betingelse.
3. For hver celle, spore og måle området af interesse (gennemsnit) og spore og måle en region uden for regionen af ​​interesse (baggrund).
4. Når du er færdig med en eksperimentel tilstand, enten kopiere målinger og indsætte i Excel eller andre regneark eller gemme målingerne.
5. Retur til trin 6,2 for hver eksperimentel tilstand.
6. Når målingerne er afsluttet, beregne resultater. Formlerne er:
   Gennemsnitlig intensitet = betyder - baggrund
   Integreret intensitet = Gennemsnitlig intensitet * område

7. Repræsentative resultater

At måle aktivering og rekruttering af de oprindelige membran-proksimale signalmolekyler Lck og Fyn som et resultat af interaktion med gp120 ved VS blev primære humane CD4 ⁺ T-celler indføres på dobbeltlag forsynet gp120 og ICAM-1 ^15. Celler, der indføres i dobbeltlag med kun ICAM-1 tjente som en kontrol for at fastlægge de basale niveauer af signalering. Specifikke fluorescensintensiteten blev målt i gp120 kontaktområde for celler på gp120 og ICAM-1 indeholdende dobbeltlag og i hele kontaktområdet for celler interagerer med ICAM-1 dobbeltlag. En stigning i gennemsnitlig fluorescensintensitet er et tegn på augmented rekruttering og aktivering af signalmolekyle til VS. Dette vil blive yderligere demonstreret ved en tilsvarende forøgelse i den integrerede fluorescensintensitet. Hvis der imidlertid ingen ændring i den integrerede fluorescensintensitet, indikerer dette en omfordeling af signalmolekyle.

Efter at cellerne interagerede med dobbeltlag indeholdende gp120 og ICAM-1, total Lck og pLck (Y394) blev rekrutteret til VS grænseflade og colocalized med gp120 (fig. 1 og 2). Den gennemsnitlige intensitet af det samlede Lck (fig. 1) var højere i dobbeltlaget indeholdende både gp120 og ICAM-1 end med ICAM-1 alene, men den integrerede intensitet niveauer (fig. 1) var ens, hvilket antyder at Lck redistribueres tilen central klynge på CD4 ^{+-T-celle-binding} til gp120. Imidlertid kvantificering af pLck (Y394) (fig. 2) viste, at den gennemsnitlige intensitet på gp120 og ICAM-1 indeholdende dobbeltlag var højere end for ICAM-1 alene dobbeltlag, og den integrerede intensitet var højere i dobbeltlagene med både gp120 og ICAM -1 end ICAM-1 alene dobbeltlag. Dette indikerer, at mens niveauerne af total Lck ved grænsefladen er ens i celler klæbe på gp120 og ICAM-1 og ICAM-1 alene dobbeltlag, gp120 binding øget phosphorylering af rest Y394 i Lck aktiveringssløjfen. I modsætning hertil var Fyn ikke rekrutteret til VS (fig. 3), som mere Fyn var til stede i kontaktområdet af celler på ICAM-1 alene dobbeltlag end på dobbeltlag indeholdende både gp120 og ICAM-1. Følgelig, konkluderer vi, at Lck, Fyn ikke er aktiv kinase i HIV-1 gp120-induceret VS.

Figurerne: Membran-proksimale signal ved HIV-1 gp120-induceret VS. Billeder af repræsentative celler pågp120 + ICAM-1 dobbeltlag (toppanelerne) og ICAM-1 dobbeltlag (nederste paneler) er vist. Fluorescensintensiteterne af de individuelle celler blev kvantificeret under manuelt føres områder af cellen fodspor, som illustreret ved det område markeret med den gule linie i figur 1. Kvantificering af de gennemsnitlige og integrerede intensiteter påvist ved TIRF mikroskopi er præsenteret i de venstre og højre grafer, hhv. I alt 30 til 350 celler blev kvantificeret for hver tilstand. Barer = 5 um. Data fra en af ​​tre gentagne forsøg er vist.

Figur 1. CD4 ⁺ T-celler blev indført på dobbeltlag indeholdende gp120 og ICAM-1 eller ICAM-1 alene i 45 min og derefter fikseret og farvet for total Lck.

Figur 2. CD4 ⁺ T-celler blev indført på dobbeltlags indeholdende gp120 og ICAM-1 eller ICAM-1 alene i 45 min og derefter fikseret og farvet for pLck (Y394).

Figur 3. CD4 ⁺ T-celler blev indført på dobbeltlag indeholdende gp120 og ICAM-1 eller ICAM-1 alene i 45 min og derefter fikseret og farvet for total Fyn.

Discussion

Tidligere undersøgelser har visualiseret VS i celle-celle-konjugat systemet, men disse forsøg har ikke tilvejebringe billeder af høj nok opløsning for at visualisere supramolekylære strukturer synapsen. I vores laboratorium, anvendes vi glas-støttede plane tolagssystem at repræsentere overfladen af ​​inficerede celler, der udtrykker viruskappen gp120 og det cellulære adhæsionsmolekyle ICAM-1. I forbindelse med TIRF mikroskopi, som detekterer fluorescens-signaler inden for 100-200 nm fra dobbeltlaget overflade med et højt signal-støjforhold, var vi i stand til at detektere supramolekylære adskillelse af gp120 fra ICAM-1 på VS. Endvidere kan standard immunfarvning metode påføres dobbeltlaget, og blev anvendt her til at detektere og kvantificere den specifikke rekruttering af aktiv Lck, men ikke Fyn, at gp120-kontaktområdet på VS ^15. Derfor er den plane dobbeltlaget giver et eksperimentelt system til høj opløsning billeddannelse af synapsen grænseflade i en 2D plan ved TIRF mikroorganismerscopy, såvel som med bredt synsfelt eller konfokal belysning metoder. Imidlertid, at systemet også begrænsninger, idet justering ligand mobilitet ud af planet bøjning, og svingninger i biologiske membraner er ikke gengivet i plane dobbeltlag. Desuden er dette en in vitro-system, og derfor har andre begrænsninger, såsom mangel på andre membranproteiner Molekyler, som ville være til stede på en inficeret celle, og cytoskelettet maskiner, der regulerer molekylær mobilitet og cellulære motilitet. Desuden kan dynamik og distribution af de molekyler, såsom trimerer versus monomerer af gp120, ikke er repræsenteret fysiologisk på dobbeltlaget. Selv med disse begrænsninger, er dette system stadig meget værdifuldt for at studere virus-celle eller celle-celle interaktioner, og disse metoder kan tjene som en nyttig vejledning til forskere, der søger billeder med høj opløsning til at registrere supramolekylær organisation, som ikke er synlig på konventionel celle-celle-konjugat system.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
His tagged HIV gp120	Gift from Dr. Cho		DH12
His tagged HIV gp120	Immune Technology		Various X4 or R5 tropic
HSA	Williams Medical Company	521302	Human Serum Albumin 25%
Amicon Ultra Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC803024	Ultracel-30K
Lck Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	2787
p-Lck Rabbit pAb	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-101728	Tyr 394
Fyn Rabbit mAb	EMD Millipore	04-353
Alexa Fluor 568 2° Ab	Molecular Probes, Life Technologies	A11034	Goat anti-Rabbit IgG (H+L)
Alexa Fluor 488	Molecular Probes, Life Technologies	A-20000	carboxylic acid succinimidyl ester
FCS2 Chamber	Bioptechs	060319-2-03
Microaqueduct Slide	Bioptechs	130119-5
30mm Round w/holes	Bioptechs	1907-08-750	0.75mm thick
Rectangle Gasket	Bioptechs	1907-1422-250	14x24 0.25mm thick
Tygon Tubing	Bioptechs	20202275	1/16" (25ft)
Three-way Stopcock	Bio-Rad	7328103
Two-way Stopcock	Bio-Rad	7328102
Sticky Slide I 0.2 Luer	Ibidi	80168
Cover glasses	Ibidi	10812
1ml syringe	BD Biosciences	309659
DOGS-NTA	Avanti Polar Lipid, Inc	790404C
DOPC	Avanti Polar Lipid, Inc	850375C
Glass coverslip	Bioptechs	40-1313-0319	40mm
TIRF microscope	Nikon Instruments
ImageJ	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/