Summary
特定のマウス系統では、ミエリン塩基性タンパク質で実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導に抵抗することができます。ここで説明するには、無反応を逆にし、いくつかの典型的なEAE耐性マウスの汚れに麻痺性疾患を引き起こす単純な予防接種プロトコルです。
Abstract
実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は中枢神経系（CNS）の炎症性疾患であり、ヒト脱髄性疾患、多発性硬化症（MS）の研究のための動物モデルとして使用されています。 EAEは中枢神経系への単核細胞の病理学的浸潤と麻痺性疾患の臨床症状によって特徴付けられる。他の耐性がありながら、MSと同様に、EAEは、その特定のマウス系統の遺伝的制御下にもあり、疾患の誘導に影響を受けています。通常、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）と免疫C57BL / 6（H-2 b）のマウスは、麻痺の兆候を開発するために失敗します。この無反応は、実験的なプロトコルがここで説明したように、確かに抗原処理やMBPの抗原提示の欠陥によるものではないC57BL / 6マウスと同様に他の有名な耐性マウス系統に深刻なEAEを誘導するために使用されていた。さらに、MBPに対する反応性C57BL / 6およびBALB / cマウスから脳炎誘発性T細胞クローンは成功していた完全に分離し、伝播されます。
実験プロトコルは、（200μg/マウス）MBP-プライミングC57BL / 6ドナーリンパ節細胞が単離され、MBP特異的T細胞のプールを拡大する抗原で5日間培養した細胞の養子免疫伝達システムを使用して含まれます。培養期間の終了時に50万人の生細胞を尾静脈を通してナイーブ同系の受信者に転送されます。ので、通常処理されたレシピエントマウスは、このように、その耐性状況を再確認し、EAEを発症しない、彼らはいつまでも通常のままでかまいません。十日後にセル転送、レシピエントマウスは、完全フロイントアジュバント（CFA）乳化側面の4つのサイトではMBPでチャレンジされています。厳しいEAEは10〜14日チャレンジ後、これらのマウスでの開発を開始します。結果は、疾患の誘導は無関係の抗原が疾患の臨床徴候を誘発しなかったとの課題として、特定の抗原であることを示した。重要なのは、抗原の投与量の滴定に使用される挑戦レシピエントマウスは、5μg/マウスのように低くなることを示した。さらに、抗原チャレンジのタイミングの運動研究では、病気を誘発するその挑戦は、5日後に抗原チャレンジと445日後に抗原チャレンジを介している限り、早ければ効果的であることが判明した。これらのデータは強く無反応を維持するために "長寿命の" T細胞集団の関与に向かって指しています。このシステムでは制御性T細胞（Tregの）の関与が定義されていません。
Protocol
1。 CFA乳化抗原を準備する
- 2 mg / mLの濃度でリン酸緩衝液（PBS）でモルモットMBP（Swanborg1の方法に従って調製し、4℃で凍結乾燥された形式で格納°C）を溶解する。合成されたMBPペプチド（MBP 60から80、SHHAARTTHYGSLPQKSQR 2）が使用されている場合は 、2 mg / mLの溶液を調製。ルアーロック付きガラスシリンジに抗原溶液（マウス1匹あたり0.1mlを免疫するために）適切な量を描画します。
- ルアーロックを備えた別のガラスシリンジに抗原溶液に等しい完全フロイントアジュバントH37Ra（0.1重量％）（CFA、ディフコ）の音量を上げて描画します。
- 三方活栓を持つ2つのガラスシリンジを接続します。前後にプランジャーを押すことにより、CFAのMBPソリューションを混在させること。エマルジョンが形成されるまで運動を続ける。
- エマルジョンが形成されるかどうかをテストするには、1つの注射器に混合物のすべてを押してください。空のシリンジを外し、tを引く彼が戻って少しプランジャと、室温で清潔な水のビーカーに残留エマルションの液滴を除去してください。エマルジョン滴の水の表面にそのまま残っている場合は、エマルジョンが形成される。エマルジョン滴分散する場合は、シリンジを接続し直して、混合の動きを続けています。
- 抗原の正確な用量の配信を保証するために予防接種プロセスのために1 mLのプラスチック製の注射器を使用しています。プラスチックシリンジに抗原エマルジョンを転送するには、プランジャーを引き出して、前のガラスシリンジは1.4のように切断された三方活栓の開口部に、空のプラスチック製の注射器を挿入します。
- ガラスシリンジのプランジャーを押すことにより、リムにプラスチックシリンジを記入してください。背面のプラスチックシリンジのプランジャーを挿入し、プラスチックシリンジで1.2 mlのマークに到達するまで戻って過剰なエマルジョンを押してください。この操作は気泡をプラスチックシリンジ内に閉じ込められていないことを保証します。
- 三方活栓からプラスチック製シリンジを取り外します。アッタ＃26ゲージの針CHプラスチックシリンジへ。エマルジョンは今針の空隙容積を埋めるように、1 mLの標線までプランジャーを押してください。
2。ドナーマウスの予防接種
注：雌C57BL / 6マウスは、通常、当初は国立衛生研究所のMcFarlinのグループ3で設計された方法に従って、側面の4つのサイト内の抗原エマルジ ョンを注入されています。経験豊かな研究者のために、一人は、全体のタスクを実行することができます。初心者のための、ヘルプが一人は、マウスを保持し、他の人が注射を行うよう要請することができます。また、マウスは注射用の麻酔をすることができます。
- 首の皮でしっかりとマウスを保持し、胸部と腹部が容易にアクセス可能であることを、例えば4 番目と5 番目の指の間に尾を抑える。
- （MOの少し右の脇の下上胸部のサイトで1mLのプラスチック注射器の針を置く使用）と抗原エマルジョン0.05 mLを皮下に注入します。白っぽいCFAの小さな膨らみが薄い皮膚を通して見ることができます。わずかに左脇の下上胸部のサイトに対しても同じことを繰り返します。
- 尾を解放し、右足（マウスの）を手に取り、それを回すと4 番目と5 番目の指の間それを保持します。右脇腹のちょうど肋骨の場合、以下のサイトを見つけて、抗原エマルジョンを0.05 mLを注入します。
- 、右足を離してマウスを他の方法にして、4 番目と5 番目の指の間に左足を（マウスの）を押し続けます。左脇腹のちょうど肋骨の場合、以下のサイトを見つけて、抗原エマルジョンを0.05 mLを注入します。
- 10匹のマウスの注射後に新鮮な針に変更するか、針が鈍くなった場合。
3。 7〜10日予防接種後の組織培養のためのリンパ節細胞の分離
- 7〜10日間の免疫後、マウスを犠牲にと所属リンパ節を削除します。安楽死の好ましい方法は、CO 2吸入によるものである。犠牲にした後、ピンと伸ばして、ボードに固定された手足の解剖ボードに背の上にマウスを置く。マウスは70％エタノールのスプレーで湿らされています。
- まで滅菌ハサミとピンセットで顎に腹部の下端から中央に長手方向に皮膚にスリットをカットします。
- 各脚の下に鼠径部の領域から腹部の皮膚を切り取ります。戻って皮をむき、鼠径部リンパ節を公開し、皮膚を突き止める。
- 皮膚が剥がれると脇の下の近くに腋窩リンパ節を公開するために釘付けにすることができるように前肢（左と右）に沿って皮膚を切り取ります。
- 一緒に仕事を鉗子の2ペアで、カバーすると鼠径部リンパ節周囲結合組織を引き離します。結合組織がクリアされると、リンパ節の下に鉗子のペアを1つ配置し、本体から引き離します。配置滅菌PBSを充填した35ミリメートルのペトリ皿のリンパ節。
- 鉗子の2ペアを使用して、2つの腋窩リンパ節を覆う結合組織を引き離します。リンパ節を分離し、ペトリ皿に置きます。出血が非常に困難なリンパ節を識別できますように領域を横断する血管を壊さないように十分注意してください。
- すべてのリンパ節が収集された後、バイオセーフティフードにペトリ皿を移動します。他のに対して1を粉砕し、鉗子の2ペアでリンパ節を分割し、いじめる。また、リンパ節は、ペトリ皿の底のリンパ節を押圧する3 mLのプラスチックシリンジのプランジャの平らな端を使用して分割することができます。
- 膜や破片を除去するためにナイロンメッシュを介してからかったリンパ節細胞懸濁液を渡します。
- 滅菌したPBSを使用して50mLにリンパ節細胞懸濁液を作る。 10分間1000rpmで遠心します。培養液中にペレットを再懸濁します。実行可能なCを行うエルは4×10 6細胞/ mLの濃度をカウントし、調整します。 UseRPMI 1640 10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、1mM MEMピルビン酸ナトリウム、0.1 mMのMEM非必須アミノ酸、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10mMのHepes緩衝液、5×を添加した10 -5 M 2-ME。細胞を再懸濁する前に、事前に暖かい文化。
- ウェルあたり2mLのボリュームで24ウェル培養プレート（最終細胞濃度8×10 6細胞/ウェル）で細胞を培養。は100μg/ mLの最終濃度で各ウェルに抗原を追加します。 5％CO 2で37℃のインキュベーター内で培養プレートを配置します。 5日間細胞をインキュベートします。
4。 5日培養開始後、培養したリンパ節細胞を採取する
- パスツールピペット、ガラスまたは少量をピペットでピペッティングすることにより、各ウェル中に細胞を混ぜます。 50 mLの遠心チューブに細胞を回収。
- 10分間1000rpmで遠心します。 ResusPBSの小さなボリュームに細胞ペレットを保留する。
- 細胞をカウントし、滅菌PBSで2.5×10 8細胞/ mLに生存細胞濃度を調整します。 ＃26ゲージの針を備えたシリンジにセルを描画します。
- 尾静脈を拡張するためのレシピエントマウスのケージの上にヒートランプを配置します。
- マウスホルダーを使用して、ホルダーのスリットを介してマウスの尾を拡張します。尻尾を拡張するために引き出します。静脈の位置を確認します。
- 5×10 7細胞に等しい、細胞懸濁液0.2 mLの/マウスを注入します。
5。レシピエントマウスの抗原チャレンジ20日後に細胞の移動と病気の症状の開発
- 抗原と病気の兆しを見せていないレシピエントマウスに挑戦しています。手順は、 "ドナーマウスの免疫化"のセクション2と同じです。
- 7〜10日、抗原チャレンジ後の麻痺性疾患の発症を観察します。
- この病気は尾の弱点で始まります。病気は1として評価されている尾は弛緩になったとき。この疾患は、マウスが1つの後肢に麻痺している2として評価されている。両後肢が麻痺し、前方のクロール時にマウスが両方の後肢をドラッグしているとき病気は3等級されています。マウスマウスが全く動かないまま、両方の前肢の使用を失ったときに病気が4等級されています。マウスが瀕死であると体が丸くなったときに病気が5等級されています。死は、悪性度疾患6 4として採点しています。
- このプロトコルは以下のC57BL / 6マウスに誘導されるMBP特異的EAEは相性です。マウスは、病気から回復するかもしれませんが、自発的再発を起こさない。
6。代表的な結果
下塗りとin vitroで展開されたドナーのリンパ節細胞に投与したマウスは、疾患の誘導への抵抗を反映して、EAEの疾患の症状を開発していませんでした。しかし、重篤な疾患は抗原チャレンジの能力を実証し、抗原チャレンジ（ 表I）の後に開発耐性機構を逆転させるインチ抗原チャレンジの2つの特殊な機能は、抗原の投与量と病気を誘発することが課題の動態についても説明します。 表IIIに示すように、抗原の非常に低用量が必要となります。抗原（ 表IV）でチャレンジしたときに驚くべきことに、前年ドナー細胞を投与したマウスは依然として深刻な疾患を発症する可能性があります。これら二つの観測が強くEAE抵抗を維持するために "長命の" T細胞の関与を示唆している。このプロトコルは、多くのEAE耐性マウス系統4に適用されます。
有名な耐性のマウス系統におけるEAEの誘導のための実験デザインの図1のフローチャート。
| 臨床EAE 移入後の | |||||||
| 歪み | 抗原 | 発生率 | AV。病気のグレード （範囲） | AV。発症日 （範囲） | 発生率 | AV。病気のグレード （範囲） | AV。発症日 （範囲） |
| SJL | MBP | 21分の21 | 4.0（3-5） | 8.0（6-10） | ND | ND | ND |
| C57BL / 6 | MBP | 0/10 | - | - | 7月7日 | 3.85（3-5） | 9.28（9-10） |
| BALB / c系 | MBP | 0/7 | - | - | 5月5日 | 3.2（3-4） | 7.0（7） |
| のC3H/HeJ MBP | 0/7 | - | - | 4月4日 | 3.2（3-4） | 8.0（8） | |
| C57BL / 6 | MBP 60から80 | 0/4 | - | - | 4月4日 | 2.75（2-4） | 10.2（9-11） |
表I。C57BL / 6マウスではMBP-媒介EAEの誘導。下塗りとin vitroで展開されたドナー細胞はC57BL / 6マウスではEAEを誘導しなかったでの養子免疫伝達。抗原チャレンジ後のセルの転送は、疾患の誘導に影響を受けやすいマウスをレンダリングされます。 AV、平均。 ND、行われません。
| 抗原チャレンジ後の臨床EAE | ||||
| プライミング抗原 | チャレンジ抗原 | 発生率 | AV。病気のグレード （範囲） | AV。発症日 （範囲） |
| MBP-CFA | CFA単独で | 0/3 | - | - |
| MBP-CFA | OVA-CFA | 0/3 | - | - |
| MBP-CFA | MBP-CFA | 3月3日 | 4.0（4.0） | 7.7（7-9） |
抗原チャレンジの表II。特異性。レシピエントマウスは、プライミング抗原だけでなく、他の無関係の抗原とチャレンジした。のみプライミング抗原は、重篤な疾患を誘発した。 OVA：ニワトリ卵白アルブミン。 AV、平均。
| 抗原チャレンジ後の臨床EAE | |||
| チャレンジ抗原用量（μg/マウス） | 発生率 | AV。病気のグレード （範囲） | AV。発症日 （範囲） |
| 200 | 4月4日 | 3.75（3-4） | 8.25（7-9） |
| 100 | 4月4日 | 3.67（3-4） | 7.5（7-8） |
| 50 | 4月4日 | 3.25（3-4） | 8.25（7-10） |
| 25 | 4月4日 | 3.0（3.0） | 8.25（8-9） |
| 10 | 4月4日 | 3.0（3.0） | 8.76（8-9） |
| 5 | 4月4日 | 2.5（2-3） | 9.75（9-10） |
| 1 | 2月4日 | 1.0（1.0） | |
| 0 | 0/4 | - | - |
表III。チャレンジ抗原の用量は、疾患の誘導に必要です。レシピエントマウスに挑戦するために使用されるMBPの種々の濃度を試験した。 AV、平均。
| 抗原チャレンジ後の臨床EAE | ||||
| チャレンジ抗原 | チャレンジの日 | 発生率 | AV。病気のグレード （範囲） | AV。発症日 （範囲） |
| MBP-CFA | 5 | 3月4日 | 1.33（1-2） | 9.67（9-10） |
| MBP-CFA | 10 4月4日 | 3.0（3.0） | 8.25（7-9） | |
| MBP-CFA | 15 | 4月4日 | 3.75（3-4） | 7.25（7-8） |
| MBP-CFA | 25 | 4月4日 | 4.0（4.0） | 8.0（7-9） |
| MBP-CFA | 35 | 4月4日 | 3.5（3-4） | 7.5（7-8） |
| MBP-CFA | 60 | 4月4日 | 3.75（3-4） | 9.0（8-10） |
| -------------------------- | ||||
| MBP-CFA | 343 | 3月3日 | 3.0（3.0） | 10.33（10-11） |
| MBP-CFA | 445 | 3月3日 | 3.0（3.0） | 7.0（7.0） |
表IV。抗原チャレンジの動力学。レシピエントマウスを採用する様々な時点ポストにチャレンジしたIVEセル転送。 AV、平均。
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Discussion
マウスではEAEの研究は、しばしばneuroantigens、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、プロテオリピドタンパク質（PLP）またはミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（MOG）を利用しています。以前の研究では、主にMBPを使用していました。 PLPは、SJLマウスから強い、一貫した応答を刺激する。最近では、MOGはB6マウスではこの抗原と疾患の誘導の影響を受けやすいので、使用される一般的な神経抗原である。遺伝子標的マウス系統の多くは、B6遺伝的背景にあります。興味深いことに、B6マウスはMOGで誘導をEAEに感受性であるが、MBPと病気の誘発に耐性がある。
多くの疾患の誘導機構、サイトカイン産生および5-7制御性T細胞により媒介される回復の効果を中心にEAEの機構解明の前の努力。 EAE耐性のマウスは、疾患の誘導を破壊するにはどうすればよい評判、一方では、広く研究されていませんでした。これは、uを定量化することの難しさが原因である可能性がありnresponsiveness。アルノン8は 1981年に最初のシクロホスファミドとB6マウスを治療するMBPで誘導したEAEの影響を受けやすく、これらのマウスをレンダリングすることを示した。その他、抗γインターフェロンによる治療も正常B6、BALB / cマウス9,10の病気を誘発した。それはこれらの研究は、すべての非抗原特異的マーカーを標的にしていることに留意すべきである。一方、ここで説明するプロトコルは、EAE抵抗の異なる側面に焦点を当てています。ここでの挑戦で使用される唯一の特定の抗原はEAE不応答を克服し、疾患の誘導を可能にすることができます。このプロトコルは、養子プライミングドナーT細胞の転送および抗原チャレンジ（表I）の感受性相とEAE抵抗相の両方を網羅しています。実験は、EAEの抵抗だけでなく、この無反応を逆に係数を維持する本質的な要因を研究するように設計することができます。当初は、それが免疫時EAE耐性マウスは自己免疫応答をマウントすることができたことが示されたMBP 4。後で、それは脳炎誘発性T細胞は、これらのマウス2に存在していることが示された。いくつかの最近の研究では、11,12（PLP）プロテオリピドタンパク質する前に、マウスの免疫化抗CD25抗体とB10.Sマウスのその治療を示したの調節性T細胞（Tregの）の役割を示唆し、耐性から感受性にマウスを変換EAE抵抗を維持します。しかし、これは、C57BL / 6マウスは同様に扱われ、MBP 13で免疫されているケースではありません。マウスのほとんどは反応しないままになります。したがって、EAE抵抗は多因子かもしれません。それがあることを仮定して、MBPに対応するC57BL / 6マウスの場合には、胸腺選択は、末梢におけるMBP反応性T細胞の頻度が非常に低いことなど、ほとんどのMBP反応性T細胞を削除しました。この下のしきい値低周波では、MBPで免疫に応答することができないマウスをレンダリングされます。チャレンジ用量は、未知のメカニズムを介して、周波数の問題とmを克服することができますount自己免疫応答。可能なメカニズムのさらなる調査はTregsのによる阻害に脳炎誘発性の感受性に影響を与えることで抗原チャレンジ中のIL-6 12の役割を含んでいるでしょう。
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Disclosures
ない財務情報開示。
Acknowledgments
国立衛生研究所からの助成金（R01 NS37253とN01 NS055167）と全国多発性硬化症協会（RG 3288-A6）によって部分的にサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guinea pig spinal cords |  Rockland Immunochemicals |
GP-T065 | frozen |
| Freund’s Adjuvant, complete H37Ra | Difco Laboratories | 231131 | |
| Multifit interchange-able syringe | BD Biosciences |
512133 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. |
10-040-CM | |
| OVA | Sigma-Aldrich |
A5503 | |
| Mice | Jackson Laboratory | B6 mice: 0000664 | Bar Harbor, Maine |
References
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