ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل<em> في الجسم الحي</em> التصوير من<em> C. ايليجانس</em>،<em> ذبابة الفاكهة</em> واسماك الزرد
Summary
وقد تم تطوير جهاز بسيط ميكروفلويديك لأداء مخدر مجانا<em> في الجسم الحي</em> تصوير<em> C. ايليجانس</em>، سليمة<em> ذبابة الفاكهة</em> اليرقات واليرقات الزرد. الجهاز يستخدم غشاء PDMS تشوه في شل هذه الكائنات نموذج لأداء التصوير مرور الوقت عمليات عديدة مثل ضربات القلب، انقسام الخلايا وشبه الخلوية النقل العصبية. نحن لشرح استخدام هذا الجهاز، وتظهر أمثلة على أنواع مختلفة من البيانات التي تم جمعها من أنظمة نموذجا مختلفا.
Abstract
مايكرو الأجهزة fluidic ملفقة توفير الوصول الجزئي للبيئة في الدراسات المجراة على الكائنات الصغيرة. عمليات تصنيع بسيطة متوفرة لأجهزة ميكروفلويديك باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة 1-3. وقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك لشبه الخلوية التصوير 4،5، في الجسم الحي ليزر 2،6 المجهرية والخلوية التصوير 4،7. في الجسم الحي التصوير يتطلب تجميد الكائنات الحية. وقد تحقق ذلك باستخدام الشفط 5،8، 6،7،9 قنوات مدبب، الأغشية تشوه 2-4،10، مع شفط تبريد إضافية 5، مخدر الغاز 11، درجة حرارة المواد الهلامية الحساسة 12، 13 و الغراء CYANOACRYLATE التخدير مثل الليفاميزول 14 ، 15. يشيع استخدام التخدير تؤثر انتقال متشابك و16،17 ومن المعروف أن يكون لها آثار ضارة على شبه الخلوية 4 النقل العصبية. في هذا شudy نظهر غشاء بولي ميثيل يعتمد-siloxane (PDMS) الجهاز الذي يسمح مخدر تجميد سليمة خالية من الكائنات نموذج الوراثية مثل ايليجانس Caenorhabditis (C. ايليجانس)، ذبابة الفاكهة اليرقات واليرقات الزرد. هذه الكائنات هي مناسبة لنموذج من الدراسات المجراة في أجهزة ميكروفلويديك بسبب صغر أقطار والهيئات شفافة بصريا أو شفافة. بأقطار تتراوح من الجسم ميكرومتر ميكرومتر إلى 10 ~ 800 ~ للمراحل الأولى من اليرقات C. ايليجانس والزرد اليرقات وتتطلب الأجهزة ميكروفلويديك من مختلف الأحجام لتحقيق الشلل الكامل لارتفاع الوقت الفاصل بين التصوير القرار. وثبتوا هذه الكائنات باستخدام الضغوط التي مارستها غاز النيتروجين المضغوط من خلال عمود السائل وتصويرها باستخدام مجهر مقلوب. صدر الحيوانات من مصيدة العودة إلى طبيعته في غضون تنقل 10 دقيقة.
علينا أن نبرهن أربعة طلبات من الوقت الفاصل بين التصوير في C. ايليجانسوهي التصوير النقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية، ما قبل متشابك الحويصلة النقل في النقل عيب متحولة والنقل مستقبلات الغلوتامات وس انقسام الخلايا أرومة عصبية. البيانات التي تم الحصول عليها من مثل هذه الأفلام تظهر أن تجميد ميكروفلويديك هو وسيلة مفيدة ودقيقة في الحصول على البيانات الجسم الحي للأحداث الخلوية وشبه الخلوية بالمقارنة مع الحيوانات تخدير (الشكل 3C 1J و 4-F).
تم تغيير أبعاد الجهاز لإتاحة الوقت الفاصل بين التصوير من مراحل مختلفة من C. ايليجانس، أولا يرقات ذبابة الفاكهة واليرقات الزرد الطور. نقل الحويصلات التي تحمل علامة synaptotagmin ذات الكلمات الدلالية مع GFP (syt.eGFP) في الخلايا العصبية الحسية تظهر الحركة الموجهة من علامات حويصلة متشابك المعبر عنها في الخلايا العصبية الحسية سليمة العاملات في 1 يرقات ذبابة الفاكهة الطور. وقد استخدم جهاز مماثل لتنفيذ الوقت الفاصل بين التصوير من نبضات القلب خلال 30 ساعة ~ الإخصاب آخر (HPF)الزرد اليرقات. هذه البيانات تظهر أن يمكن تطبيق أجهزة بسيطة وضعنا لمجموعة متنوعة من نظم نموذجية لدراسة الظواهر البيولوجية والخلية عدة التنموية في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS الأجهزة ميكروفلويديك شفافة بصريا بالتالي يمكن استخدامها لتصوير بجودة عالية في الجسم الحي من أي كائن نموذج شفاف / شفافة. لدينا تصميم مناسب لتصوير عالية المكانية والزمانية التكبير من الأحداث الخلوية وشبه الخلوية في الحيوانات الحية سليمة. باستخدام تقنيات الطب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور راي Krishanu للأسهم ذبابة الفاكهة، Tarjani أغاروال للحفاظ على قفص ذبابة الفاكهة، بيتر Juo لnuIs25 وCGC لC. ايليجانس السلالات. أدلى SPK jsIs609 في المختبر مايكل Nonet ل. نشكر آربان أجنيهوتري (BITS بيلاني) لمساعدته في الوقت الفاصل بين التصوير النقل الميتوكوندريا من الحيوانات jsIs609 في أجهزة ميكروفلويديك. ونحن ممتنون للدكتور براكاش Vatsala كرومالاي وSURYA لتزويدنا الأجنة الزرد. نشكر الدكتور كريشنا والمكاتب المركزية الوطنية في CIFF لاستخدام المجهر القرص الغزل مبائر بدعم من وزارة العلوم والتكنولوجيا مركز لتقنية النانو-(رقم SR/55/NM-36-2005). نشكر أيضا Kaustubh راو، فينكاترامان V. وSachidanand Chetana للمناقشات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الزمالة ما بعد الدكتوراه DBT (SM)، DST المسار السريع مخطط (SM) ومنحة لDBT (SPK). وأيد SA من المنح وDST CSIR لSPK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
- Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. 유전학. 95, 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
- Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
- Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
- Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
- Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
- Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
- Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
- Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
- Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
