התקני microfluidic פשוטים עבור<em> In vivo</em> הדמיה של<em> ג elegans</em>,<em> דרוזופילה</em> ודג זברה
Summary
מכשיר microfluidic פשוט פותח כדי לבצע הרדמה חופשיה<em> In vivo</em> הדמיה של<em> ג elegans</em>, שלם<em> דרוזופילה</em> זחלים וזחלי דג זברה. המכשיר מנצל PDMS קרום deformable לשתק אורגניזמים המודל הבא על מנת לבצע זמן לשגות הדמיה של תהליכים רבים כגון קצב לב, חלוקת תא והובלה עצבית משנה הסלולר. אנו מדגימים את השימוש במכשיר זה ולהראות דוגמאות לסוגים שונים של נתונים שנאספו ממערכות מודל שונות.
Abstract
מכשירי fluidic מייקר מפוברק לספק סביבת מייקרו נגישה למחקרי vivo על אורגניזמים קטנים. תהליכי ייצור פשוטים זמינים עבור התקני microfluidic באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות 1-3. התקני microfluidic שמשו במשך הדמית משנה הסלולר 4,5, in vivo ליזר microsurgery 2,6 וסלולרית הדמיה 4,7. בחי ההדמיה דורשת קיבוע של אורגניזמים. זו הושגה באמצעות שאיבה 5,8, ערוצים מחודדים 6,7,9, ממברנות deformable 2-4,10, יניקה עם קירור נוסף 5, הרדמת גז 11, ג'לים רגיש לטמפרטורה 12, דבק cyanoacrylate 13 והרדמה כגון levamisole 14 , בן 15. הרדמה נפוצה להשפיע על הולכה סינפטית 16,17 וידועים יש השפעות מזיקות על 4 הובלה עצביות משנה הסלולר. ברחוב זהג'ודי אנחנו מדגימים קרום בסיס פולי דימתיל-siloxane מכשיר (PDMS) המאפשר קיבוע ללא הרדמה של אורגניזמים מודל גנטיים תקינים כגון elegans Caenorhabditis (סי אלגנס), זחלי דרוזופילה וזחלי דג זברה. אורגניזמים מודל אלו מתאימים למחקרי vivo במכשירי microfluidic בגלל קוטרם הקטן והגופים שקופים אופטי או שקופים. קטרי גוף לנוע בין ~ 10 מיקרומטר ל ~ 800 מיקרומטר לשלבים מוקדמים של זחל ג זחלי elegans ודג זברה ודורש התקני microfluidic בגדלים שונים כדי להשיג קיבוע מלא ל הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות. אורגניזמים אלה משותקים באמצעות לחץ המופעל על ידי גז חנקן דחוס דרך עמודת נוזל וצלם באמצעות מיקרוסקופ הפוך. בעלי חיים ששוחררו מהמלכודת לחזור לתנועה רגילה בתוך 10 דקות.
אנחנו מדגימים ארבעה יישומים של הדמית זמן לשגות בג elegansכלומר, תחבורת הדמית המיטוכונדריה בתאי עצב, תחבורת שלפוחית מראש הסינפטי בתחבורת תחבורה-פגומת מוטציה, קולטן הגלוטמט וחלוקת תא neuroblast ש. נתונים שהתקבלו מסרטים כאלה מראים שקיבוע microfluidic הוא אמצעי שימושי ומדויק של רכישה בנתוני vivo של אירועים הסלולר ומשנה הסלולר בהשוואה לחיות מורדמות (האיור 1J ו3C-F 4).
מידות מכשיר שונו כדי לאפשר הדמית זמן לשגות בשלבים שונים של ג elegans, תחילה זחלי instar דרוזופילה וזחלי דג זברה. הובלה של שלפוחית מסומנים synaptotagmin מתויג עם GFP (syt.eGFP) בנוירונים חושיים תערוכות תנועה מכוונת של סמני שלפוחית סינפטיים לידי ביטוי בתאי עצב תחושתיים כולינרגיות בזחלי תסיסנית שלמים 1 instar. מכשיר דומה כבר נעשה שימוש כדי לבצע הדמית זמן לשגות של פעימות לב ב~ הפרית הודעת שעה 30 (hpf)דג זברת זחלים. נתונים אלו מראים כי מכשירים הפשוטים שפתחנו ניתן ליישם במגוון רחב של מערכות מודל ללמוד כמה תאי תופעות ביולוגיות וההתפתחותי בגוף חי.
Protocol
Representative Results
Discussion
התקני microfluidic PDMS הם שקופים אופטי ולכן ניתן להשתמש בו לרזולוציה גבוהה בתחום הדמית vivo של כל אורגניזם מודל שקוף / שקוף. התכנון שלנו הוא מתאים להדמית הגדלה גבוהה זמנית spatio של אירועים הסלולר ומשנה הסלולר בבעלי חיים שלמים. Microfabrication באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר Krishanu ריי למניות תסיסנית, Tarjani Agarwal לשמירת תסיסנית כלוב, פיטר Juo לnuIs25 וCGC לג זני elegans. SPK עשה jsIs609 במעבדתו של מייקל התשיעייה. אנו מודים Arpan Agnihotri (Pilani BITS) על עזרתו בזמן לשגות הדמיה של תחבורת מיטוכונדריה של jsIs609 בעלי חיים בהתקני microfluidic. אנו מודים לד"ר Vatsala Thirumalai וסורייה פראקאש שספק לנו עוברי דג זברה. אנו מודים לד"ר קרישנה וCIFF בבנק המרכזי לאומי לשימוש במיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב נתמך על ידי משרד מדע וטכנולוגיה, המרכז לננוטכנולוגיה (מס SR/55/NM-36-2005). אנו מודים גם לKaustubh ראה, ו 'Venkatraman וChetana Sachidanand לדיונים. עבודה זו מומנה על ידי מלגת DBT פוסט הדוקטורט (SM), ערכת מסלול מהיר DST (SM) וDBT מענק ל( SPK). SA נתמך על ידי מענקי DST וCSIR לSPK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
- Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. 유전학. 95, 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
- Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
- Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
- Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
- Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
- Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
- Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
- Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
- Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
