Semplici dispositivi microfluidici per<em> In vivo</em> Imaging di<em> C. elegans</em>,<em> Drosophila</em> E Zebrafish
Summary
Un semplice dispositivo microfluidico è stato sviluppato per eseguire anestetico libera<em> In vivo</em> Imaging<em> C. elegans</em>, Intatto<em> Drosophila</em> Larve e larve di zebrafish. Il dispositivo utilizza una membrana deformabile PDMS per immobilizzare questi organismi modello per eseguire lapse imaging tempo di numerosi processi come il battito cardiaco, la divisione cellulare e subcellulare trasporto neuronale. Abbiamo illustrato l'utilizzo di questo dispositivo e mostrano esempi di diversi tipi di dati raccolti da diversi sistemi modello.
Abstract
Micro dispositivi fabbricati fluidici fornire un micro-ambiente accessibile per gli studi in vivo su piccoli organismi. Processi di fabbricazione semplici sono disponibili per i dispositivi microfluidici che utilizzano tecniche di litografia morbidi 1-3. Dispositivi microfluidici sono stati utilizzati per la sub-cellulare di imaging 4,5, in vivo laser microchirurgia 2,6 e 4,7 di imaging cellulare. In vivo imaging richiede immobilizzazione di microrganismi. Questo è stato ottenuto utilizzando aspirazione 5,8, 6,7,9 canali conici, membrane deformabili 2-4,10, aspirazione con raffreddamento supplementare 5, gas anestetico 11, gel sensibili alla temperatura 12, 13 e colla cianoacrilato anestetici come levamisole 14 , 15. Anestetici comunemente usati influenzare la trasmissione sinaptica 16,17 e sono noti per avere effetti nocivi sulla sub-cellulare 4 Trasporti neuronale. In questa study si dimostra una membrana a base di poli-dimetil-silossano (PDMS), dispositivo che permette di immobilizzazione senza anestetico intatte organismi modello genetiche come Caenorhabditis elegans (C. elegans), larve di Drosophila e larve di zebrafish. Questi organismi modello sono adatti per gli studi in vivo in dispositivi microfluidici causa dei loro diametri piccoli e organismi otticamente trasparenti o traslucide. Diametri del corpo vanno da ~ 10 micron a ~ 800 micron per i primi stadi larvali di C. elegans e zebrafish larve e richiedono dispositivi microfluidici di diverse dimensioni per ottenere l 'immobilizzazione completa ad alta risoluzione time-lapse imaging. Questi organismi sono immobilizzati mediante pressione esercitata dal gas azoto compresso attraverso una colonna di liquido e ripreso utilizzando un microscopio invertito. Animali rilasciati dalla trappola tornare alla normale locomozione entro 10 min.
Dimostriamo quattro applicazioni di time-lapse imaging in C. elegansvale a dire, il trasporto di imaging mitocondriale nei neuroni, pre-sinaptico di trasporto delle vescicole in un trasporto difettoso-mutante, il trasporto recettori del glutammato e la divisione neuroblasti Q cellulare. I dati ottenuti da questi film mostrano che l'immobilizzazione microfluidica è un mezzo utile e preciso di acquisire dati in vivo di eventi cellulari e sub-cellulari rispetto agli animali anestetizzati (Figura 1J e 3C-F 4).
Dimensioni del dispositivo sono state modificate per consentire time-lapse imaging di diverse fasi di C. elegans, Drosophila primo stadio le larve e larve di zebrafish. Trasporto di vescicole contrassegnati con synaptotagmin contrassegnati con GFP (syt.eGFP) nei neuroni sensoriali mostra movimento diretto di marcatori delle vescicole sinaptiche espressi nei neuroni colinergici sensoriali intatte prima larve instar Drosophila. Un dispositivo simile è stato utilizzato per effettuare time-lapse imaging del battito cardiaco in ~ 30 ore dopo la fecondazione (HPF)Zebrafish larve. Questi dati mostrano che i dispositivi semplici che abbiamo sviluppato può essere applicato ad una varietà di sistemi modello per lo studio di fenomeni biologici diversi cellulari e di sviluppo in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS dispositivi microfluidici sono otticamente trasparente, pertanto può essere utilizzata per alta risoluzione immagini in vivo di qualsiasi trasparente / traslucido organismo modello. Il nostro design è adatto per l'alta ingrandimento spazio-temporale di immagini di eventi cellulari e sub-cellulari in intatti animali vivi. Microfabrication con tecniche di litografia soft permette una facile manipolazione delle dimensioni del dispositivo disponibili per varie dimensioni di organismi modello. Dispositivi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Krishanu Ray per gli stock di Drosophila, Tarjani Agarwal per il mantenimento di una gabbia di Drosophila, Peter Juo per nuIs25 e CGC per C. elegans ceppi. SPK fatto jsIs609 nel laboratorio di Michael Nonet. Ringraziamo Arpan Agnihotri (BITS Pilani) per il suo aiuto in time-lapse imaging di trasporto dei mitocondri jsIs609 animali in dispositivi microfluidici. Siamo grati al Dr. Vatsala Thirumalai e Surya Prakash per averci fornito embrioni di zebrafish. Ringraziamo il Dott. Krishna e CIFF a BCN per l'uso del microscopio confocale disco rotante sostenuto dal Dipartimento di Scienze e Tecnologie-Centro per le Nanotecnologie (n. SR/55/NM-36-2005). Ringraziamo anche Kaustubh Rau, V. Venkatraman e Chetana Sachidanand per le discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dal DBT post-dottorato (SM), DST accelerata regime (SM) e una borsa di studio a DBT (SPK). SA è stata sostenuta da sovvenzioni DST e CSIR a SPK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
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