のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で></emの>イメージング<em> Cエレガンス</em><em>ショウジョウバエ</em>とゼブラフィッシュ
Summary
シンプルなマイクロ流体デバイスは、麻酔薬を無料で行うために開発されました<em生体内で></emの>イメージング<em> Cエレガンス</em>無傷<em>ショウジョウバエ</em>幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。デバイスは、心拍、細胞分裂や細胞内輸送などの多数の神経プロセスのタイムラプスイメージングを実行するために、これらのモデル生物を固定化するために変形されたPDMS膜を利用しています。我々は、この装置の使用方法を示す、別のモデルシステムから収集したデータの様々なタイプの例を示しています。
Abstract
マイクロ流体デバイスを作製は、小さな生物に関するin vivo研究のためのアクセス可能な微小環境を提供します。シンプルな製造プロセスは1-3ソフトリソグラフィ技術を用いて、マイクロ流体デバイスのために用意されています。マイクロ流体デバイスは、 生体内レーザー顕微2,6と細胞イメージング4,7 のサブ細胞イメージング4,5、のために使用されている。in vivoイメージング生物の固定化を必要とします。これは、吸引5,8を使用して達成されている、先細チャネル6,7,9、変形可能な膜2-4,10、追加の冷却5、麻酔ガス11、温度感受性ゲル12、シアノアクリレート接着剤13や14のような麻酔レバミゾールと吸引、15。一般的に使用される麻酔薬は、シナプス伝達16,17に影響を与え、細胞内神経輸送4に有害な影響を有することが知られている。本STにおけるudy我々はそのような線虫Caenorhabditis elegans（線虫C. elegans）、ショウジョウバエの幼虫とゼブラフィッシュの幼虫のようにそのまま遺伝的モデル生物の麻酔フリー固定化を可能にするポリジメチルシロキサン（PDMS）装置による膜を実証している。これらのモデル生物は、それらの小さい直径および光学的に透明または半透明の体のマイクロ流体デバイスを用いたin vivo研究では適しています。本体の直径はCの初期の幼虫のために約10μmから約800μmの範囲虫やゼブラフィッシュ幼生と高解像度タイムラプスイメージングのための完全な固定化を達成するために、異なるサイズのマイクロ流体デバイスを必要とします。これらの生物は、液体カラムを通して圧縮窒素ガスによる圧力を用いて固定し、倒立顕微鏡を用いて結像される。トラップから解放動物が10分以内に通常の歩行に戻ります。
我々は、Cのタイムラプスイメージングの4つのアプリケーションを実証エレガンスすなわち、神経細胞におけるイメージングミトコンドリア輸送、輸送欠損変異株、グルタミン酸受容体輸送とQ神経芽細胞の細胞分裂における前シナプス小胞輸送。映画などから得られたデータは、マイクロ流体固定化は麻酔動物（ 図1Jと3C-F 4）と比較した場合、携帯電話とサブ細胞事象のin vivoデータ取得の有用かつ正確な手段であることを示している。
デバイスの寸法は Cの様々な段階のタイムラプスイメージングを可能にするように変更されました線虫 、 ショウジョウバエの初齢幼虫とゼブラフィッシュの幼虫。感覚神経細胞にGFP（syt.eGFP）でタグシナプトタグミンでマーク小胞の輸送はそのまま初齢ショウジョウバエの幼虫のコリン作動性感覚神経細胞で発現シナプス小胞マーカーの指示の動きを示しています。似たようなデバイスが〜30時間後に受精（HPF）でハートビートのタイムラプスイメージングを行うために使用されています幼虫をゼブラフィッシュ。これらのデータは、我々が開発したシンプルなデバイスが生体内でいくつかの細胞生物学的および発達現象を研究するためのモデルシステムの様々に応用できることを示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMSマイクロ流体デバイスは、したがって、任意の透明/半透明モデル生物のin vivoイメージング高分解能のために使用することができる光学的に透明である。当社のデザインはそのまま生きた動物における細胞およびサブ細胞事象の高倍率時空イメージングに適しています。ソフトリソグラフィ技術を用いて微細加工は、モデル生物の様々なサイズのためのデバイスの寸法を簡単に操作…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、CのnuIs25とCGCのためのピーター十王、 ショウジョウバエケージを維持するために、ショウジョウバエの株式、Tarjani Agarwalさんのために博士Krishanuレイに感謝エレガンス株。 SPKはマイケルノネの研究室でjsIs609を作った。我々は、マイクロ流体デバイスにおけるjsIs609動物のミトコンドリア輸送のタイムラプスイメージングで彼の助けArpan Agnihotri（BITSピラニ）に感謝。我々は、ゼブラフィッシュ胚を提供してくれるための博士VatsalaティルマとスーリヤPrakashさんに感謝しています。我々は、ナノテクノロジー（第SR/55/NM-36-2005）のための科学と技術 – センターの部門によってサポートされ回転するディスク共焦点顕微鏡の使用のNCBで博士クリシュナとCIFFに感謝します。我々はまた、議論のためKaustubh Rauさん、V. VenkatramanとChetana Sachidanandに感謝します。この作品は、DBTポスドクフェローシップ（SM）は、DSTのファスト·トラック制度（SM）とによる助成（SPK）によって賄われていた。 SAはSPKにDSTとCSIR補助金によって支えられている。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Silicon wafers | University wafer | 150 mm (100) Mech Grade SSP Si | |
| Clewin Software | WieWeb software | Version 2.90 | |
| Laser plotter | Fine Line Imaging | 65,024 DPI | |
| HMDS | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | |
| SU8 | Microchem | SU8-2025, SU8-2050 | |
| Developer | Microchem | SU8 Developer | |
| Silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| PDMS | Dow corning | Sylgard 184 | |
| UV lamp | Oriel | 66943 | 200W Hg Oriel Light |
| Hot air oven | Ultra Instruments | Custom made | Set at 50 °C |
| Hot plate | IKA Laboratory Equipment | 3810000 | http://www.ika.com |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Spinner | Semiconductor Production Systems | SPIN150-NPP | www.SPS-Europe.com |
| Glass cover slip | Gold Seal | 22 X 22 mm, No. 1 thickness | |
| C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | e1265, ayIs4 | |
| Drosophila | Bloomington | P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP | |
| Zebrafish | Indian wild type | Wild type | |
| Tygon tube | Sigma | Z279803 | |
| Micro needle | Sigma | Z118044 | Cut into 1 cm pieces |
| 3-way stopcock | Sigma | S7521 | |
| Harris puncher | Sigma | Z708631 | |
| Compressed nitrogen gas | Local Gas supplier | Use a regulator to control the pressure | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Andor & Olympus | Yokogawa spinning disc confocal microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | www.rsbweb.nih.gov/ij | Java based image processing program |
References
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